重組減毒沙門菌對乳腺癌細胞的抑制作用

藍肇煜，王小月，李丹，武靜橋，范真瑋，姚景麗，趙微，何敬文，陳婷，金天明

(天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384)

起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤稱為乳腺癌(breast cancer)。乳腺腫瘤是雌性動物中最常見的腫瘤，特別是小動物的重要臨床疾病之一[1]。犬是乳腺腫瘤發病率最高的動物，未絕育的母犬發病率高達71%[2]。采用常規腫瘤治療方法后，高風險乳腺癌病畜仍會死于腫瘤復發和轉移。因此，尋找合適的載體和治療藥物將會極大改善乳腺癌對雌性動物的傷害。

研究顯示，實體瘤有一個顯著特性，即伴隨著腫瘤的快速生長，導致供氧不足，在其內部會出現低氧區(氧含量為1%，正常組織中為3%～15%)。腫瘤低氧區的存在形成了天然的厭氧環境，又由于腫瘤內部的免疫抑制作用，壞死區中細胞裂解產生的營養物質，以及新生血管破裂等原因，為兼性或厭氧菌生長提供了有利環境，使有些厭氧菌或兼性厭氧菌可以靶向腫瘤，并在腫瘤中生長，這一發現預示著某些厭氧菌或兼性厭氧菌有望成為攜帶抗腫瘤藥物的載體，這其中尤以沙門菌為典型代表[3]。減毒菌株鼠傷寒沙門菌LH430(phoP/phoQ基因缺失)在敲除了鼠傷寒沙門菌的phoP/phoQ基因后，菌株毒力與親本菌株相比大為降低，但仍保留了親本菌株的侵襲力，是適宜的疫苗及載體候選菌株[4]。

腫瘤靶向肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)是細胞能夠識別的最小的蛋白質一級結構上所特有的結構單位，可有效識別腫瘤血管整合素αvβ3[5]。由于乳腺癌細胞表面存在整合素αvβ3，RGD能夠高度靶向乳腺癌細胞，進而抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲。

細胞穿膜肽(CPPs)又稱蛋白質轉導結構域(PTDs)，是一組不超過35個氨基酸殘基，可有效地內化細胞，攜帶偶聯藥物進入細胞的小肽，且不引起細胞毒性反應。TAT是一種11聚體的細胞穿膜肽，來源于人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)編碼的轉錄反式激活蛋白，是保持細胞穿膜能力的最小蛋白，也是自發現細胞穿膜肽以來研究和使用最廣泛的肽。

白樹毒素(gelonin，簡稱GEL)是一種Ⅰ型核糖體失活蛋白(RIPs)，單鏈核糖體失活蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性，可專一性水解真核細胞核糖體28S rRNA中第4 324位腺苷酸的N-C鍵，釋放1個腺嘌呤(A)使核糖體失活，從而抑制蛋白質生物合成，導致細胞死亡[6-7]。同時，GEL又具有類 DNase 活性，可使細胞核中 DNA降解[8]。

本研究選擇GEL基因作為乳腺癌的治療基因，同時利用LH430和RGD對腫瘤細胞的雙靶向作用及TAT細胞穿透作用，構建了攜帶RGD-TAT-GEL三基因的減毒沙門菌，增強GEL基因的穿透細胞能力，使其更高效地殺傷腫瘤細胞。同時，借助雙靶向作用，可進一步降低GEL基因對正常細胞的損傷，從而實現靶向抑瘤的目的。

1 材料與方法

1.1 主要材料

沙門菌LH430由吉林大學基礎獸醫學實驗室惠贈；乳腺癌細胞MDA-MB-231由天津師范大學朱長軍教師惠贈；含質粒pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL和pMD-RGD-GEL的重組大腸桿菌由上海捷瑞生物工程有限公司合成；HEK-293細胞和pEGFP-N1質粒由本實驗室保存。

TRIzol Reagent購自北京天恩澤基因科技有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小提試劑盒、SanPrep 柱式 DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶購自Thermo Scientific公司。

1.2 引物設計

根據GenBank 中 RGD 基因序列(1FUL_A)、TAT基因序列(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)和GEL基因序列(AAB47013.1)設計RGD-TAT-GEL基因引物；根據RGD基因序列(1FUL_A)和GEL基因序列(AAB47013.1)設計RGD-GEL基因引物；根據TAT基因序列(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)和GEL基因序列(AAB47013.1)設計TAT-GEL基因引物，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物信息

1.3 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL質粒制備與鑒定

根據試劑盒說明書提取大腸桿菌中的pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL、pMD-RGD-GEL和pMD-GEL重組質粒，用限制性內切酶EcoRⅠ/BamHⅠ分別進行雙酶切?；厥誖GD-TAT-GEL基因、RGD-GEL基因、TAT-GEL基因和真核表達載體pEGFP-N1雙酶切產物。采用T4連接酶將回收的目的基因與載體16 ℃連接過夜，并測序。

1.4 重組沙門菌的構建

將減毒沙門菌LH430轉化為感受態細胞，按照文獻[9]方法將質粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL和pEGFP-N1分別轉化至LH430感受態細胞，通過卡那霉素抗性培養基篩選出陽性菌株，利用引物F1/R1對RGD-TAT-GEL基因和RGD-GEL基因進行PCR鑒定，引物F2/R1對TAF-GEL基因進行PCR鑒定，陽性重組菌分別命名為 LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL和LH430/pEGFP-TAT-GEL，-80 ℃保存備用。

1.5 重組減毒沙門菌侵染MDA-MB-231細胞及外源基因檢測

將MDA-MB-231細胞分為5組，每組3孔，每孔1×105個細胞加入6孔板中，并加入2 mL含10% FBS的DMEM完全培養液。待細胞融合度至70%～80%時，PBS洗滌2次，用無血清無抗DMEM培養液培養2 h，每組分別加入50 μL(1×106CFU/mL)LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL 和LH430/pEGFP，置于 5% CO2培養箱，37 ℃孵育3 h，PBS洗滌2次，每孔加入10% FBS的DMEM完全培養液2 mL，于37 ℃培養箱孵育3 h后，換為無血清無抗DEME培養液，培養6～48 h后，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況。采用 TRIzol法從侵染 48 h后的MDA-MB-231細胞中提取細胞總 RNA，利用逆轉錄試劑盒獲得cDNA后，以其為模板，分別以 F1/R1、F2/R1為引物，PCR 檢測目的基因。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，73 ℃ 1 min，35 個循環；73 ℃ 15 min。

1.6 CCK-8法檢測重組沙門菌對細胞增殖的影響

將MDA-MB-231細胞、HEK-293細胞各分5組，分別重懸于含10% FBS的DMEM和MEM完全培養液中，調整細胞濃度至5×104個/mL，于96孔板中加入100 μL細胞懸液，37 ℃培養箱培養，待細胞融合度至60%時，換為無血清無抗DMEM培養基，每組加入LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL 和LH430/pEGFP各10 μL，每個重組菌用無血清無抗培養液依次稀釋1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU/μL，置于CO2培養箱中培養24、48和72 h。到達檢測時間時，于每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃孵育1 h，用酶標儀在450 nm波長處檢測光吸收值。

使用GraphPad Prism軟件繪制抑制率圖表，通過SPSS軟件用One-way ANOVA方法計算抑制率和標準差，利用SPSS軟件中的Probit分析CCK-8結果計算出半數抑制濃度(IC50)值并用One-way ANOVA方法計算其標準差。抑制率計算方法：各重復孔的OD值取“均數±標準差”，用1-(OD值-空白OD值)/(陰性對照孔OD值-空白OD值)×100%獲得各種藥物的抑制率。

2 結果與分析

2.1 pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL質粒的鑒定

將提取后的pMD-RGD-TAT-GEL、pMD-TAT-GEL、pMD-RGD-GEL和pMD-GEL重組質粒用限制性內切酶EcoRⅠ/BamHⅠ進行雙酶切。將膠回收的基因片段經T4連接酶連接后，測序結果與預期相符，表明上述重組質粒構建成功。

2.2 構建重組沙門菌的鑒定

將含質粒pEGFP-RGD-TAT-GEL、pEGFP-RGD-GEL、pEGFP-TAT-GEL的重組減毒沙門菌，進行PCR鑒定，獲得857、824和830 bp的預期目的片段(圖1)，表明成功構建重組減毒沙門菌。

M.250 bp-Ⅰ DNA ladder；1.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL(857 bp)；2.LH430/pEGFP-TAT-GEL(830 bp)；3.LH430/pEGFP-RGD-GEL(824 bp)

2.3 重組減毒沙門菌侵染MDA-MB-231細胞檢測

重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL和LH430/pEGFP-TAT-GEL侵染MDA-MB-231細胞24、48和72 h后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光(圖2)。經LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL侵染的細胞表達綠色熒光最明顯。

a.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL; b.LH430/pEGFP-TAT-GEL; c.LH430/pEGFP-RGD-GEL; d.LH430/pEGFP-N1

2.4 RT-PCR檢測目的基因

PCR檢測重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL中的RGD-TAT-GEL、RGD-GEL 和TAT-GEL基因，在857、824和830 bp處獲得目的片段(圖3)，表明重組菌在MDA-MB-231細胞中成功表達RGD-TAT-GEL、RGD-GEL 和TAT-GEL基因。

M.250 bp-Ⅰ DNA ladder; 1.RGD-GEL(824 bp); 2.TAT-GEL(830 bp); 3.RGD-TAT-GEL(857 bp)

2.5 CCK-8法檢測重組沙門菌對細胞增殖的影響

2.5.1 不同時間濃度重組菌對MDA-MB-231細胞的抑制效果

重組減毒沙門菌對MDA-MB-231細胞的抑制力隨劑量增加而增強，但沒有出現時間和劑量的依賴性，LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL組48 h時抑制率為68%，顯著高于其他組(P<0.05)(圖4)。

A.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL；B.LH430/pEGFP-RGD-GEL；C.LH430/pEGFP-TAT-GEL；D.LH430/pEGFP-N1；同一處理組間比較，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.5.2 不同時間濃度重組菌對HEK-293細胞的抑制效果

重組減毒沙門菌對HEK-293細胞的抑制力普遍較低，明顯低于對MDA-MB-231細胞的抑制力，且沒有出現時間和劑量的依賴性(圖5)。說明重組菌對腫瘤細胞靶向性較好，對正常細胞損傷較小。

A.LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL；B.LH430/pEGFP-RGD-GEL；C.LH430/pEGFP-TAT-GEL；D.LH430/pEGFP-N1

2.6 各組重組菌對腫瘤細胞及正常細胞的IC50值

將CCK-8數據進行分析并計算各重組菌對MDA-MB-231細胞和HEK-293細胞的IC50值。結果顯示LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL組對MDA-MB-231細胞的IC50值最低，為(4.643±0.514)×107CFU/μL，對HEK-293細胞的IC50值最高，為(2.376±0.260)×109CFU/μL，說明其抑瘤效果最佳，且對正常細胞損傷較小(圖6)。

圖6 各重組菌對MDA-MB-231細胞和HEK-293細胞的IC50值分析結果

3 討論

目前，癌癥治療的主要障礙是藥物的低效力，因此，人們更多地利用蛋白質或基因開展腫瘤治療研究，然而，這些大分子卻不能穿透細胞膜[10]。研究表明，PTDs是將生物活性大分子傳遞到完整細胞中最有效的工具，能夠將小分子藥物、大分子甚至納米顆粒送入所有類型的細胞中，其轉導機制強于其他內化途徑[11]。Shin等[12]的研究表明，經穿膜肽TAT修飾后，GEL基因的表達效率與GEL單基因相比提高了177倍，但因缺乏腫瘤特異性，故需其他靶向修飾。Low等[13]和Robert[14]改造出VNP20009和A1-R等擁有抑瘤能力的菌株，由于安全性原因，改造菌的抑瘤效果并不顯著，因此，尋找有效的靶向基因和治療基因顯得尤為重要。進一步研究顯示，鼠傷寒沙門菌是眾多治療腫瘤細菌中的理想候選[15]。Ham等[16]將穿膜肽F3與GEL基因構建成嵌合肽，對HeLa、LnCaP、9L和U87 MG癌細胞進行靶向性試驗，結果顯示，在所測癌細胞中觀察到F3-GEL表達量都較高，殺傷作用較強，說明GEL基因殺傷力極強，在穿膜肽的協同作用下，可高效率消滅腫瘤細胞。

本研究首次構建出能夠高效穩定表達外源基因的重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL、LH430/pEGFP-RGD-GEL、LH430/pEGFP-TAT-GEL、LH430/pEGFP-GEL和LH430/pEGFP。CCK-8試驗結果顯示，重組沙門菌沒有出現對時間和劑量的依賴性，對于MDA-MB-231細胞，LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL 組48h時抑制效果最佳，IC50值最低。對于HEK-293細胞，各重組沙門菌均顯示出較低的殺傷力，且LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL 組的IC50值最高，說明對腫瘤細胞具有更高的靶向性。

本研究結果中，LH430/pEGFP-N1組對腫瘤細胞同樣有殺傷作用，其原因為一方面細菌可以通過其自身的毒力物質，如內毒素和侵襲素等誘導宿主細胞凋亡；另一方面宿主細胞經刺激后可產生如腫瘤壞死因子、白細胞介素、凋亡蛋白等作用于自身并引起凋亡[17]。由于減毒沙門菌 LH430 本身便具有抑制腫瘤生長的能力，因此，亦可誘導細胞凋亡。同時因本研究采用重組減毒沙門菌治療，在侵入腫瘤組織后能夠誘導機體產生細胞免疫和體液免疫反應，使免疫細胞集中于腫瘤組織，從而促進腫瘤細胞的凋亡，與Felgner等[15]的結論一致。

本試驗的研究結果證明，重組減毒沙門菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL靶向效果良好，抑瘤效果明顯，為下一步腫瘤動物模型的試驗研究奠定了基礎。