基于SSR分子標(biāo)記的糯玉米遺傳多樣性研究

楊亞桐　董安憶　劉松濤　Zenda Tinashe　段會(huì)軍

摘要：為明確糯玉米自交系間的親緣關(guān)系，利用19對(duì)簡單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記對(duì)32份糯玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測到80個(gè)等位基因變異，每個(gè)位點(diǎn)可檢測到2～7個(gè)等位基因變異，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測到4.21個(gè)。通過NTSYS聚類分析方法，在遺傳相似系數(shù)為0.53處將32份糯玉米自交系劃分為6個(gè)類群，分別包含3份、2份、11份、11份、2份和3份，其中親緣關(guān)系較近的白糯6和突變體N17聚在了一起，3個(gè)雜交種（鄭黃糯2號(hào)、石彩糯和京科糯）的父母本被劃分在不同的類群中，進(jìn)一步從分子水平上揭示了親本種質(zhì)的遺傳差異與玉米雜種優(yōu)勢的關(guān)系，為玉米育種和改良奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：糯玉米;SSR;遺傳多樣性;聚類分析

中圖分類號(hào)： S513.032

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0083-04

收稿日期：2019-01-14

作者簡介：楊亞桐（1994—），男，河北河間人，碩士研究生，主要從事作物遺傳資源與利用研究。E-mail：1539245869@qq.com。

通信作者：段會(huì)軍，博士，教授，主要從事作物遺傳資源與利用研究。E-mail：hjduan@hebau.edu.cn。

糯玉米（Zea mays L. var. ceratina Kulesh）是玉米屬的一個(gè)亞種[1]，是普通玉米第9染色體短臂上的Wx基因發(fā)生隱性突變形成的一種蒸煮后呈糯性的突變體[2-3]，由于糯玉米籽粒干燥后胚乳呈角質(zhì)不透明、無光澤的蠟質(zhì)狀，所以又被稱作蠟質(zhì)玉米[4]。根據(jù)糯玉米籽粒的顏色可以分為：白糯、黃糯、紫糯、黑糯以及彩糯等，其中白糯和黃糯較為常見[5]。糯玉米具有富含支鏈淀粉[6]、營養(yǎng)豐富和適口性良好等優(yōu)良特性，現(xiàn)已成為深受人們歡迎的食品和工業(yè)原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

SSR（simple sequence repeats，簡單重復(fù)序列）又稱為微衛(wèi)星DNA[7]，是共顯性分子標(biāo)記，是建立在PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）基礎(chǔ)之上的一種遺傳標(biāo)記，具有很高的多態(tài)性和覆蓋率，測得結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性比較好，試驗(yàn)操作程序簡單，對(duì)DNA的數(shù)量和純度要求較低[8]。國內(nèi)外研究學(xué)者在玉米遺傳多樣性方面做了大量的研究工作，李銳等利用SSR技術(shù)對(duì)來源于144份甜玉米群體的40個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了分析，共檢測到343個(gè)等位變異，每對(duì)引物測出4-17個(gè)等位變異，平均8.58個(gè)，SSR聚類分析將144份甜玉米群體劃為7個(gè)類群[9];谷靜叢利用28對(duì)SSR引物對(duì)110份普通玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，將其劃分為六大類群，19個(gè)亞類群[10];Warburton等[11]、Reif等[12]的研究結(jié)果證實(shí)了利用SSR標(biāo)記進(jìn)行玉米遺傳多樣性及雜種優(yōu)勢群劃分的可行性。

盡管SSR分子標(biāo)記較普遍地應(yīng)用于植物的遺傳多樣性研究上，但在糯玉米種質(zhì)資源中的研究報(bào)道比較少。本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)32份糯玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，確定供試糯玉米自交系間的遺傳背景差異，為糯玉米優(yōu)良品種選育和雜種優(yōu)勢模式構(gòu)建提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料選自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)鮮食玉米課題組選育的26份糯玉米自交系，編號(hào)為N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10、N11、N12、N13、N14、N15、N16、N17（白糯6突變體）、N18、N19（石白糯1號(hào)）、N20、N21、N22、N23、N24、N25、N26和引進(jìn)的國審糯玉米品種鄭黃糯2號(hào)父母本（鄭黃糯04、鄭黃糯03）、石彩糯父母本（石糯1號(hào)、石糯2號(hào)）及京科糯父母本（白糯6、京糯6）。

1.2 方法

1.2.1 用CTAB法提取玉米葉片基因組DNA 將玉米種子浸泡1夜，播種（每個(gè)品種播3粒）;待玉米長到3～4葉時(shí)取葉提取玉米基因組DNA。具體提取步驟：（1）將無水乙醇放入-20 ℃冰箱中預(yù)冷，CTAB放入65 ℃水浴鍋中預(yù)熱1 h。（2）取新鮮玉米葉片加入適量已預(yù)熱好的CTAB中研磨，分別裝入1.5 mL離心管中，放入65 ℃水浴鍋中水浴60～75 min。（3）從水浴鍋中取出，加入等體積的氯仿異戊醇（24 ∶1）。使用搖床搖晃或用手上下翻轉(zhuǎn) 20 min。（4）放入離心機(jī)中，10 000 r/min離心 10 min。（5）取上清液至新離心管中，加入等體積氯仿異戊醇，搖晃15 min。放入離心機(jī)中，10 000 r/min離心10 min。（6）取上清液至新的離心管中，加入 -20 ℃ 預(yù)冷好的無水乙醇至1.5 mL，緩緩搖晃，出現(xiàn)白色絮狀沉淀（DNA），放入冰箱-20 ℃中冷卻 5 min。（7）從冰箱中取出DNA，放入離心機(jī)中離心，10 000 r/min，10 min，棄上清液。（8）加入75%乙醇（75 mL 95%乙醇+20 mL蒸餾水）70 μL，將DNA彈起，搖晃10 min，充分洗滌DNA，放入離心機(jī)中 10 000 r/min離心2～3 min。棄上清，共洗脫3次。（9）將洗脫好的DNA開蓋晾干，晾1夜即可，第2天可加去離子水溶解（100 μL）。（10）測量DNA濃度（放-20 ℃冰箱中保存）。

1.2.2 SSR引物 選用19對(duì)SSR引物（表1），由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng) 20 μL PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 2.0 μL;Buffer 2.0 μL;上下游引物各1.0 μL;Taq DNA Polymerase 0.2 μL;dNTP 1.6 μL;ddH2O 12.2 μL。體系混合均勻后加1小滴礦物油（全過程在冰上進(jìn)行）。

PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性 40 s，X ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。10 ℃保溫。注意X ℃退火，具體退火溫度參考引物Tm值;擴(kuò)增完成后，放入冰箱4 ℃保存。

[5]田 蜜. 糯玉米配合力和雜種優(yōu)勢的分析[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[6]鄒春華，徐勛志，陳同良. 東北地區(qū)糯玉米高效栽培技術(shù)[J]. 吉林蔬菜，2015，（11）：6-7.

[7]Kantety R V，La R M，Matthews D E，et al. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley，maize，rice，sorghum and wheat[J]. Plant Molecular Biology，2002，48（5/6）：501-510.

[8]蔣思霞，倪正斌，印志同，等. 糯玉米自交系遺傳多樣性及其產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀與SSR分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（6）：3212-3217，3283.

[9]李 銳，白建榮，王秀紅，等. 144份甜玉米群體的遺傳多樣性分析[J]. 作物雜志，2018（2）：17-24.

[10]谷靜叢. 110份玉米自交系遺傳多樣性分析[D]. 天津：天津農(nóng)學(xué)院，2015.

[11]Warburton M L，Xianchun X，Crossa J，et al. Genetic characterization of CIMMYT inbred maize lines and open pollinated populations using large scale fingerprinting methods[J]. Crop Science，2002，42（6）：1832.

[12]Reif J C，Melchinger A E，Xia X C，et al. Genetic distance based on simple sequence repeats and heterosis in tropical maize populations[J]. Crop Science，2003，43（4）：1275.

[13]楊文鵬，關(guān) 琦，楊留啟，等. 貴州70份玉米自交系的SSR標(biāo)記遺傳多樣性及其雜種優(yōu)勢群分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，12（2）：241-248.

[14]張振良，郝德榮，陳國清，等. SSR標(biāo)記在糯玉米品種鑒定上的應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（6）：104-106.

[15]程宇坤. 山西省糯玉米自交系的遺傳多樣性分析及類群劃分[D]. 太原：山西大學(xué)，2012.

[16]胡建廣，祁喜濤，李余良. RAPD技術(shù)應(yīng)用于超甜玉米種子鑒定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2002（6）：25-27.

[17]孟 強(qiáng). 糯玉米種質(zhì)SSR標(biāo)記遺傳分析及品質(zhì)性狀評(píng)價(jià)[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[18]邢 政. 東北地區(qū)主要糯玉米自交系聚類分析及雜種優(yōu)勢的利用[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.付三雄，周曉嬰，張潔夫，等. 高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)化學(xué)殺雄兩系雜交油菜寧雜559的選育和種子生產(chǎn)技術(shù)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（2）：87-91.