種子處理對PEG-6000模擬滲透脅迫下棉花發芽的影響

張衛杰　韓松　吉慶勛　李志明　楊曼麗　黨永富　喬傳令

摘要：為探討干旱脅迫下不同處理劑對包衣棉花種子萌發的影響，以不同藥種比例二次拌種處理，用質量濃度10、20 g/L的PEG-6000溶液模擬土壤干旱進行發芽試驗。對干旱脅迫下種子萌發期的相對發芽率、相對幼芽含水率、相對發芽指數、相對活力指數、萌發抗旱指數、相對平均發芽速率等指標進行測定，應用多元統計分析方法進行抗旱性綜合評價，以確定不同處理劑的作用效果以及棉花萌芽期簡單易用的抗旱鑒定指標。結果表明：（1）隨著PEG-6000質量濃度的升高，各處理的發芽指數相對值、活力指數相對值、萌發抗旱指數相對值和綜合抗旱評價值（D值）總體上呈下降態勢。（2）處理劑Ⅰ提高種子萌發抗旱性的作用效果明顯優于處理劑Ⅱ。（3）與抗旱綜合評價相關的相對發芽指數、相對幼芽含水率、相對鮮質量和相對平均發芽率4個指標可有效鑒定不同處理的種子萌發抗旱性。

關鍵詞：棉花;PEG脅迫;萌發期;抗旱性

中圖分類號： S562.01;Q945.78

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0091-06

收稿日期：2019-01-26

作者簡介：張衛杰（1990—），男，河南周口人，碩士，研究方向為重金屬遷移與轉化。E-mail：1317282732@qq.com。

通信作者：喬傳令，博士，研究員，主要從事環境生物學研究。E-mail：qiaocl@ioz.ac.cn。

水資源短缺是目前公認的全球性環境焦點問題之一，中國干旱及半干旱地區面積占全國總耕地面積的48%，干旱脅迫對農作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位[1-2]，已經成為限制農業發展的重要障礙。棉花作為我國重要的經濟作物多分布于鹽堿干旱地區，而且其生長的主要季節為高溫干旱的夏季，水分匱缺成為棉花播種期或其他關鍵生育期生長發育的限制性因素[3]。隨著生物技術的飛速發展，提高農作物的抗旱性已經成為農業研究領域的熱點之一。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是由微生物發酵產生的一種γ-谷氨酸鏈狀高聚物，它富含側鏈羧基，具有無毒、無害、無殘留等特性，還具有高吸水保水性，在農業上常用作保水劑和種子包衣劑[4-6]。用電子束轟擊γ-PGA制成的樹脂對種子進行包埋后，種子能夠在沙漠和缺水地區順利發芽[7]。施用γ-PGA水浸液或直接拌種，可提高小麥出苗率[8]。在用聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱脅迫下，使用外源γ-PGA后，可提高小麥和黑麥草的發芽率[8-9]，增強水稻幼苗的耐旱性[10]。迄今為止，γ-PGA用于抗干旱的研究大多集中于小麥、水稻、玉米等作物，在棉花上的相關研究較為滯后。本研究將γ-PGA與其他成分復配后配合種衣劑處理棉花種子，并利用高分子滲透劑PEG-6000模擬干旱脅迫，通過分析不同處理棉花種子的發芽特性，對與種子萌發期抗旱性相關的多個指標進行系統分析與鑒選，初步建立抗旱性評價指標體系，并對不同處理的種子進行萌發抗旱性綜合評價，為種子處理技術在干旱條件下的棉花生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為中棉所42（已用20%拌種靈·福美雙·鋅包衣），由中國農業科學院棉花研究所選育，種子處理劑Ⅰ、Ⅱ由河南奈安生物科技股份有限公司/農藥副作用及藥害防控技術河南省工程實驗室自主研發。處理劑Ⅰ主要有效成分：γ-聚谷氨酸、水溶性腐殖酸和無機鹽;處理劑Ⅱ主要有效成分：γ- 聚谷氨酸、生化黃腐酸和聚陰離子纖維素。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理 選取顆粒飽滿大小一致的棉花種子置于40 ℃恒溫箱中干燥24 h，分別用處理劑樣品處理后自然晾干，拌種比為1 ∶50、1 ∶75和 1 ∶100。然后置于質量濃度為0、10、20 g/L（對應的滲透勢分別為0、-0.15、-0.46 MPa）的PEG-6000溶液中于25 ℃培養箱中光暗交替恒溫培養 12 d，每24 h補充1次水分使滲透勢維持不變，以芽長超過0.5 cm且無腐爛變質的種子為正常發芽，每天開始統計發芽數和芽長。共設置15個處理（表1），每個處理設2個培養皿，每皿100粒，重復2次。培養皿（直徑 9 cm）和濾紙事先121 ℃高溫滅菌消毒 30 min，每個培養皿墊2層風干的濾紙。

1.2.2 測定指標及方法 種子開始培養后每天觀察并記錄種子發芽情況;培養至第8天調查種子發芽情況（發芽數、鮮質量、干質量），計算發芽率、發芽指數、幼芽含水率、活力指數、種子萌發抗旱指數、干物質脅迫指數等指標。

式中：Gt表示在第t天的發芽數;Dt表示與Gt相對應種子出芽經歷時間;S表示規定時間（7 d）內單株幼苗的生物量（干質量）。

幼芽含水率=1-幼芽干質量/幼芽鮮質量;種子萌發抗旱指數=水分脅迫下種子萌發指數（PIS）/對照種子萌發指數（PIC），其中PI=1.00nd2+0.75nd4+0.5nd6+0.25nd8（nd2、nd4、nd6、nd8分別是2、4、6、8 d的種子萌發率）[12];干物質脅迫指數=干旱下幼苗干質量/對照幼苗干質量[13]。

1.2.3 數據統計與分析 數據整理與分析采用Excel 2007軟件。參照周廣生等的方法[14-15]將各指標的原始數據轉化為相對值，運用SPSS 18.0軟件對各指標的相對值進行主成分分析，并利用隸屬函數值對不同處理的棉花種子萌芽期的耐滲透脅迫進行綜合評價。運用的主要公式如下：

2 結果與分析

2.1 測定指標相對值的分析

由表2可見，在PEG-6000模擬滲透脅迫下，各處理的指標與正常對照相比（相對值）均受到了不同程度的影響，不同處理經模擬滲透脅迫后其發芽率、發芽指數、活力指數、萌發指數基本上均有所下降（相對值<1），而鮮質量和幼芽含水率大部分都有所上升（相對值>1）。PEG-6000濃度為 20 g/L 的各處理的發芽指數相對值、活力指數相對值和萌發抗旱指數相對值均小于PEG-6000濃度為10 g/L的各處理，但不同處理各單項指標的變化幅度不盡相同，各有差異。各指標的相對值在一些文獻中又叫做抗脅迫系數或抗旱系數[16-18]，僅指示該指標下的耐冷性強弱。由于各處理的抗旱性和各指標所提供的信息均有較大差異，如僅根據單一指標的測定值得出結論難免有一定的片面性，所以需要將這些指標綜合起來進行抗旱性評價。

2.2 萌發期抗旱指標的主成分分析

Bouslama等提出，根據種子在高滲溶液或在不同滲透勢土壤中的發芽率和發芽勢來評價萌發期抗旱性，并提出用種子萌發抗旱指數來反映種子在高滲溶液中的發芽勢和發芽率，在一定程度上能間接反映作物萌發期的抗旱性[19]。本試驗將種子萌發抗旱指數作為代表各處理抗旱性強弱的指標與測定的各項指標進行相關性分析（表3），并將表2提供的數據作為主成分分析的原數據矩陣，利用軟件進一步分析得到各項指標的相關系數矩陣，根據相關系數矩陣，得出各綜合指標的特征值，篩選特征值>1的主成分并計算得到各指標的主成分特征向量（表4）。

表3相關性分析顯示：發芽率、發芽指數和活力指數與種子萌發抗旱指數的相關系數明顯高于其他指標，相關極顯著（P<0.01），即以上3個指標在一定程度上與各處理棉花種子萌發的抗旱性密切相關，這與表4中主成分CI-1傳遞的信息一致。由表4可知第一、第二和第三主成分的貢獻率分別是57.364%、18.905%和13.643%，三者累計貢獻率達89.912%，代表了所測指標的絕大部分信息，其他主成分可忽略不計。從特征向量上各個獨立指標在綜合指標中的貢獻率來看，第一主成分（CI-1）中種子萌發抗旱指數、發芽指數、活力指數、發芽率所占的比重較大，說明這些指標可以較好地反映種子萌發的抗旱性;第二主成分（CI-2）中鮮質量、干物質脅迫指數、幼芽含水率所占的比重較大;第三主成分（CI-3）中幼芽含水率、干物質脅迫系數和鮮質量所占比重較大，說明這些指標與種子萌發的抗旱性也存在一定關系。

2.3 抗旱性綜合評價

在各主成分的特征向量（表4）及各指標的相對值（表2）基礎上，可分別求出每個處理的3個綜合指標值（表5）。在干旱脅迫下，同一綜合指標數值越大，說明該處理在這一綜合指標上的抗旱性越強，反之越差。但各處理的抗旱性由這3個綜合指標值所共同決定，單獨用任何一個綜合指標都無法準確評價出不同處理種子萌發的抗旱性。因此在綜合指標基礎上結合權重利用隸屬函數計算各處理綜合抗旱能力的大小（D值）更具科學性，結果見表5。

從表5中不同處理的D值和排序對比發現：相同排序位次下，所有Ⅰ類D值>Ⅱ類D值，說明模擬滲透脅迫壓力越大（PEG-6000處理質量濃度越高），對棉花種子萌發的影響越大，抗旱能力越弱;而抗旱劑處理后在輕度模擬滲透脅迫下（PEG-6000處理質量濃度為10 g/L）棉花包衣種子萌芽期的抗旱性（D值）基本上要優于高濃度模擬滲透脅迫（PEG-6000處理質量濃度為20 g/L）的抗旱性。事實上，處理1是Ⅰ類的對照，處理2是Ⅱ類的對照，在Ⅰ類中超過處理1排序位次的是處理5（第1位）、處理3（第2位）和處理13（第3位），在Ⅱ類中超過處理2排序位次的是處理4（第1位）、處理6（第2位）和處理14（第3位）。在表1中處理3至處理6均采用處理劑Ⅰ，拌種比1 ∶50～1 ∶75，處理13、處理14采用處理劑Ⅱ，拌種比1 ∶100，處理劑Ⅱ的各處理排序位次均在處理劑Ⅰ之下，說明使用處理劑Ⅰ提高種子萌發抗旱性的作用效果明顯優于處理劑Ⅱ，其最佳拌種比為1 ∶50和1 ∶75。處理13、處理14的排序在Ⅰ類和Ⅱ類的對照之上，說明處理劑Ⅱ使用拌種比 1 ∶100 也具有提高種子萌發抗旱性的效果。

2.4 回歸分析

從上述分析結果（表4）可以看出，不同指標對棉花抗旱性貢獻大小不同。進一步以抗旱性綜合評價值（D值）作因變量，各單項指標相對值作自變量，通過逐步回歸分析建立多元線性逐步回歸方程，并獲取對抗旱性評價最重要的指標。回歸方程見表6，回歸模型經回歸系數測驗和決定系數驗證，都達到極顯著水平，而且回歸方程（4）的相關系數達0.998，高于回歸方程（5）的相關系數（0.845），說明前者的擬合度更好，模型更準確，而且說明該模型涉及的指標（發芽指數、幼芽含水率、相對鮮質量和平均發芽速率）是種子萌發抗旱性的關鍵指標，可有效鑒定棉花種子萌發的抗旱性。在模擬滲透脅迫下，這些指標與萌發抗旱性存在線性關系，而回歸方程（6）表明直接決定萌發抗旱指數的僅有發芽指數和發芽率這2個指標，而且方程（5）的相關系數小于方程（4），因此用萌發抗旱指數直接衡量萌發抗旱性存在偏差。

3 結論與討論

作物在生長發育過程中對缺水最敏感，水分欠缺會使生長減緩或停止。因此在干旱條件下作物生長狀況的差異可用來評定不同處理抗旱性的差異，而形態指標具有簡單易測的優點，反映了作物在遭受干旱脅迫后植株的整體表現，在鑒定中經常采用，成為簡便有效的抗旱性鑒定方法[17]。

一般采用種子萌發試驗，即用不同質量濃度的PEG-6000或甘露醇對種子發芽進行滲透脅迫處理，可以揭示作物在萌發期的抗旱能力[20-21]。種子在高滲溶液或在不同滲透勢的土壤中萌發，可根據其發芽勢和發芽率來評價抗旱性[19]。一般在滲透脅迫條件下發芽率降低，胚根與胚芽的生長受到不同程度的抑制，使貯藏物質轉運效率降低。其中發芽率和胚根干質量與萌發抗旱指數呈極顯著正相關[22]。作物干旱一段時間后測定幼苗的株高、含水率和干質量，并與對照比較（株高脅迫指數、相對含水率和干物質脅迫指數），由此鑒定相關的抗旱性，該方法簡單有效，已在大豆、棉花、小麥等作物上得到應用[17]。本研究通過主成分分析和多元回歸分析顯示發芽率、萌發抗旱指數、發芽指數和含水率等指標能夠明確地反映萌發抗旱性，與前人的研究結果基本一致。

在主成分分析（表4）中種子萌發抗旱指數、發芽指數、活力指數、發芽率可以較好地反映種子萌發的抗旱性，而在回歸分析（表6）中發芽指數、鮮質量、幼芽含水率、平均發芽速率直接影響各處理種子萌發的綜合抗旱性，各指標與后者的關系呈線性。說明萌發抗旱指數和活力指數并不是直接影響種子萌發抗旱性，與后者的關系呈非線性。發芽指數幾乎直接決定萌發抗旱指數[表6方程（6）]，兩者的相關系數r高達0.975（表3、表6），兩者僅反映干旱時的發芽率和發芽勢，代表的是種子發芽力[11]。而直接決定各處理萌發抗旱性相關的指標不僅有發芽指數，還有反映種子萌發吸水能力的幼芽含水率和不屬于種子發芽力范圍之外的幼芽鮮質量[表6方程（4）]，因此，種子處理對模擬干旱環境下棉花發芽的作用不僅在于影響種子自身的發芽力，還影響種子萌發生長過程中對水分的吸收和自身的生長發育，所以萌發抗旱指數明確反映的是種子萌發力抗旱性，雖然在一定程度上能夠間接反映種子萌發抗旱性，但若要全面體現這種抗旱性則具有片面性和局限性。

由于主成分分析可以把單一的關系錯綜復雜的指標轉換成新的個數較少的且彼此獨立或不相關的綜合指標，比較準確地了解各性狀的綜合表現，因此對與萌發抗旱性相關指標的分析比較全面詳細，而直線回歸分析篩選相關指標則更加直接簡單。本研究綜合利用這2種分析方法分辨不同指標與萌發抗旱性的關系，并結合隸屬函數和綜合評價方法判定不同處理的種子萌發抗旱性，并以此區分不同處理劑的作用效果更加科學合理。

利用外源物質提高作物抗旱性的研究比較普遍，目前已報道的主要有冠菌素、茉莉酸或茉莉酸甲酯、乙烯利、赤霉素、吲哚乙酸·萘乙酸等激素及其類似物質[23-25]，黃腐酸類光譜植物生長調節劑以及聚丙烯酰胺、γ-聚谷氨酸等高分子有機保水劑[26-27，10]。茉莉酸類物質是廣泛存在于植物體內的一類生長調節物質，包括茉莉酸、茉莉酸甲酯及其結構類似物冠菌素等，此類物質具有應答外界刺激，傳導逆境信號及啟動抗逆基因表達等生理效應，調節作物幼苗體內的激素平衡來誘導其形態的改變，增強其抗旱性[23-24]。黃腐酸能控制作物葉面氣孔的開放度，減少蒸騰，增強根系發育和根系活力，促進植物的生長，從而增強植物的抗旱性及抗逆能力，提高作物產量和品質[28]。γ-PGA作為一種具有極強親水性的高分子聚合物處理種子，在種子表面形成一層膜，能阻止水分流失，為種子發芽提供了所需要的水分，而且還可以調節植物內源激素水平及其穩態平衡，促進種子萌發和幼苗生長發育[29-30]。部分激素及其類似物如使用不當易在土壤和作物體內殘留，不僅影響作物生長發育，而且引發食品安全問題[31]，因此本研究選取無毒無害、綠色環保的腐殖酸類（黃腐酸）、γ-PGA作為主要成分復配處理劑，研究發現該處理劑提高了干旱脅迫下種子的發芽率、發芽指數、活力指數和萌發抗旱指數，增強包衣棉花種子萌發時的抗旱性，具有一定的應用價值。

綜上所述，應用不同處理劑對包衣棉花種子二次拌種后各處理種子萌發抗旱性存在差異，這與不同處理劑的有效成分不同以及拌種比例不同有關，也可能與種衣劑和處理劑之間的互作有關。在適當范圍內，種子處理后的萌發抗旱性明顯優于對照，但其在大田中的效果如何尚待進一步研究。

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