基于液相色譜串聯高分辨質譜的動物源農產品獸藥殘留檢測研究綜述

王卉　劉慶菊　韓平

摘要：液相色譜-高分辨質譜（LC-HRMS）具有高分辨率、高通量、高精確度等優勢，在動物源農產品的獸藥殘留檢測研究中顯示出極大的潛力。本文綜述了2014—2018年LC-HRMS檢測動物源農產品中獸藥殘留的應用研究進展。其中，QuEChERS方法和有機溶劑提取法是常用的獸藥殘留提取方法，提取液用PSA、C18和氧化鋁等吸附劑凈化，綠色的樣品前處理方法是未來的發展趨勢;液相系統和色譜柱的改良，使獸藥化合物得到更好的分離，提高了質譜檢測的靈敏度;HRMS分辨率和靈敏度的提高，增強了LC-HRMS定性定量分析動物源農產品中獸藥殘留的能力;數據處理軟件的開發和應用，提高了LC-HRMS在獸藥殘留檢測中的工作效率。盡管LC-HRMS在獸藥殘留檢測中取得了進展，但仍存在不足和發展空間。

關鍵詞：液相色譜（LC）-高分辨質譜（HRMS）;動物源農產品;獸藥殘留;樣品前處理;色譜分離;質譜檢測;數據處理

中圖分類號： TS207.5+3

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0057-08

收稿日期：2018-11-08

作者簡介：王 卉（1982—），女，內蒙古鄂倫春人，博士，助理研究員，主要從事農產品安全檢測工作。E-mail：wangh@brcast.org.cn。

通信作者：韓 平，副研究員，主要從事農產品安全檢測工作。E-mail：hanp@brcast.org.cn。

獸藥殘留是畜禽產品質量的主要監控指標，獸藥的不科學使用會導致動物體內藥物蓄積，對人類及環境產生慢性、長遠和積累性的影響。獸藥經畜禽代謝后，通常以原藥的形式進入環境中，引起土壤污染、水污染和植物蓄積，環境中的獸藥殘留再通過食物鏈進入人體，影響人體健康[1]。當人體中的獸藥殘留蓄積到一定量時，會引起人體毒性反應，導致癌變、畸變、基因突變等不良后果[2]。因此，動物源農產品的獸藥殘留問題已經成為國際上公認的農業和環境問題[3]。

液相色譜（LC）-高分辨質譜（HRMS）檢測技術是動物源農產品中獸藥殘留檢測分析的常規技術手段[4]，LC能夠分離非揮發性化合物和大部分揮發性化合物[5]，HRMS具有高精確度、高通量、全掃描等優勢，LC與HRMS聯用可全面獲取樣品中化合物[6]的精確分子質量和碎片離子信息，區分同分異構體和同重化合物，鑒定未知物[7]。

在LC-HRMS檢測動物源農產品中獸藥殘留的研究中，首先通過樣品前處理來提取和凈化樣品中的獸藥化合物，前處理方法的選擇直接影響檢測結果。經前處理后的樣品，通過液相色譜進行分離，以降低基質的復雜程度，獲得高質量的質譜數據[8-9]。然后再用HRMS進行檢測分析，常用HRMS有飛行時間（TOF）質譜、四級桿飛行時間（QTOF）質譜、軌道阱質譜（Orbitrap）、線性離子阱-軌道阱質譜（LTQ-Orbitrap）、四級桿-軌道阱質譜（Q-Orbitrap）等[10-13]，隨著HRMS分辨率和靈敏度的不斷提高[14-17]和質譜采集數據量的增大，需不斷開發和優化相應軟件來處理數據。

本文概述了2014—2018年LC-HRMS在動物源農產品的檢測研究中，涉及樣品前處理、液相分離、質譜檢測、數據處理等方面的研究現狀，并對該技術未來的發展趨勢進行展望，旨在為此類研究提供參考。

1 樣品前處理

提取和凈化是LC-HRMS檢測動物源農產品中獸藥殘留的主要步驟，溶劑提取法和QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）方法是獸藥殘留常用的提取方法[18-26]。提取后得到的樣品中可能存在共提物，會增加檢測噪聲，因此須進一步凈化處理將其去除，以降低檢測的檢測限和定量限。

當采用溶劑提取法提取動物源農產品中的獸藥殘留時，單一溶劑提取可能無法取得滿意效果，此時可采用多種溶劑混合提取，如Chiesa等用有機溶劑提取魚中的21種抗生素時發現，單獨使用濃度為70%的甲醇（含0.1%甲酸）提取，或者單獨使用乙腈（含0.1%甲酸）對樣品進行提取，均不能使所有目標化合物取得滿意的回收率，因此將試驗分為2步，首先用酸化甲醇提取，再用酸化乙腈提取，最終獲得了滿意的回收率[27]。此外，可以在提取過程中應用其他提取方法輔助提取來降低檢測限，如2015年，Cepurnieks等用5%三氯乙酸 （TCA）溶液提取牛奶中的26種抗生素[28]，檢測濃度<100 ng/mL。2018年，Saluti等用0.25%TCA水溶液提取牛奶中14種抗生素時，引入超聲來輔助提取，使檢測限≤33 μg/kg[29]。

QuEChERS方法是一種通用的前處理方法[30]，可同時提取樣品中的多種獸藥殘留。根據化合物的不同性質，可改變QuEChERS方法中溶劑、酸、鹽、吸附劑等的種類和用量，提高獸藥殘留提取回收率[31]，除方法的改進外，QuEChERS方法提取自動前處理平臺的應用是此項術進步的重要表現，自動化處理不僅減少了試劑對環境的污染，同時減少了人為因素對試驗的影響，如Jia等應用QuEChERS自動前處理平臺提取了鱸魚中的24種大環內酯類藥物及其代謝產物[32-45]。

凈化處理是提高獸藥檢測靈敏度的重要方法。常用的吸附劑有N-丙基乙二胺（PSA）、C18、氧化鋁和硅酸鎂等。近年來，科研人員對吸附劑凈化效果的研究不斷細化，如Chen等用QuEChERS方法提取雞肉中的16種β-內酰胺類藥物，試驗用QuEChERS凈化管（150 mg C18，300 mg PSA 和900 mg 無水硫酸鎂）凈化提取液，上機檢測的檢測限（LOD）為0.01～0.35 μg/kg，定量限（LOQ）為003～1.16 μg/kg[23]，Lopez-Garcia等也采用QuEChERS方法來提取雞肉中的獸藥殘留[22]，并評價了 PSA、硅酸鎂、C18鍵合鋯膠（Z-Sep+）、氧化鋁和C18等吸附劑的凈化效果，發現經硅酸鎂和氧化鋁凈化后的檢測靈敏度最好，而其他的吸附劑對目標化合物有吸附，導致靈敏度低。

動物源農產品中獸藥殘留提取和凈化方法的選擇，要基于樣品基質的理化性質和研究目的，如果前處理方式不當，可能導致基質干擾嚴重，有些重要的化合物未被提取，或在提取過程中丟失，進而影響研究結果。

2 色譜分離

在LC-HRMS檢測動物源農產品的獸藥殘留研究中，LC分離能夠降低樣品的復雜程度，利于質譜對樣品進行準確全面的檢測。與HRMS串聯使用的LC，已經從高效液相色譜（HPLC）改進為超高效液相色譜（UPLC），UPLC的分辨率、靈敏度和穩定性都優于HPLC。同時，色譜柱的改良也有力地推動了LC-HRMS在動物源農產品獸藥殘留檢測中的應用。

在獸藥殘留的液相色譜分析研究中，以硅膠為基質的反相色譜柱在獸藥檢測中的應用最為廣泛[46]。其中，反相C18色譜柱可保留非極性化合物，而苯基柱適合分析親水性化合物[47]。與反相色譜柱相比，親水相互作用色譜柱（HILIC）對極性強的獸藥化合物的保留效果更好[48-49]。而且色譜柱填料的改進使色譜柱性能更加優異，具體表現在填料顆粒的體積變小，超高效液相色譜柱的填料顆粒小于2 μm，因此分離效果更好，峰寬變窄[50]，色譜的峰容量得到提高，分離效果得到改善，減少了質譜中的離子抑制。液相色譜柱可承受的壓力增加，高達 1 500 bar[51]，對樣品的洗脫速度加快，縮短了樣品的分析時間[52]。Zhao等在應用LC-Q-Orbitrap測定斑石鯛中的80種獸藥殘留（獸殘）的研究中，對6種反相色譜柱分離樣品的效果進行了比較，其中色譜柱直徑和填料孔徑尺寸最小的亞乙基雜化橋顆粒（BEH） C18色譜柱的分離能力、效率和靈敏度優于其他5種色譜柱[36]。

近年來，微流液相色譜（μLC）、毛細管液相色譜（CLC）及納升液相色譜（nano LC）與HRMS的聯用提高了HRMS的檢測靈敏度[53-54]，是未來LC-HRMS檢測發展的重要方向。Alcantara-Duran等應用nano LC-HRMS定量檢測蜂蜜、牛奶、牛肉和雞蛋等樣品中的87種獸藥，將前處理后的樣品稀釋100倍，nano LC-HRMS仍能夠檢測到溶液中的目標化合物[37]，極大地提高了檢測靈敏度。Mirabelli等用nano LC-HRMS檢測殺蟲劑的檢測限可達到10 pg/mL[55]。

3 質譜檢測

電噴霧電離（ESI）源是液相色譜-質譜（LC-MS）應用中最常用的接口之一。ESI電離是一種軟電離方式，電離效率高。Araceli等采用ESI、大氣壓化學電離（APCI）和大氣壓光電離（APPI）3種電離方式對5種化合物的電離效果進行比較研究，結果表明，化合物經ESI電離后，產生的峰面積和信噪比明顯高于APCI和APPI[56]。在LC-MS的應用研究中，超過80%的研究選用了ESI離子源，而APCI和APPI電離方式報道較少[57]。

樣品經離子源電離后，進入質譜檢測。HRMS具有高分辨率，能提供高精確度的全掃描數據，有良好的定性能力[11，58-60]。特別是當檢測的同分異構體或同重化合物的保留時間和精確質量數相同而無法區分時，可以通過碎片離子信息的差異作進一步的區分。因此，碎片離子信息采集的是否全面，是評價高分辨質譜性能的重要評價指標。目前，常用的HRMS數據采集模式主要分為數據依賴型采集（DDA）和數據非依賴型采集（DIA）。DDA采集時，質譜自動從全掃描一級質譜（FS MS）轉換成全掃描二級質譜（FS MS/MS），后者是在前者的基礎上開發出來的，包括離子碎片采集（AIF）和MSE采集模式等，能夠獲得所檢測質量范圍內所有的母離子和碎片離子信息。此外，離子淌度技術也是HRMS分離同分異構體和同重化合物的重要技術，該技術在電場中根據離子的大小、結構和電荷對其進行分離[61-62]。

HRMS的分辨率隨硬件的發展不斷提高。如Qtof是四級桿與飛行時間質譜串聯的儀器，它在實際檢測中的分辨率<30 000，主要用來做定性試驗，可提供一級和二級質譜數據作為定性判斷依據，Nacher-Mestre等用UPLC- Xevo G2 Qtof定性篩查了動物加工副產品中的150種獸藥，當基質加標量為0.2 mg/kg時可檢測出75%獸藥，當基質加標量為0.1 mg/kg 時可檢測出65%的獸藥，當加標量為0.02 mg/kg時可檢測出30%的獸藥[42]。而 LTQ-Orbitrap 的分辨率高于Qtof，分辨率設置范圍為7 500～100 000，可以提供多級質譜數據作定性定量研究。Saito-Shida等對146種化合物進行定量測定時，比較了應用LC-Orbitrap-MS建立的方法和應用LC-QTOF-MS建立方法的線性、回收率、精密度和基質效應，結果表明Orbitrap-MS的選擇性和靈敏度優于QTOF-MS[63]，而且LTQ-Orbitrap的多級質譜（MSn）數據采集模式可以為獸藥及其代謝物的鑒定提供更豐富的碎片離子信息。比LTQ-Orbitrap性能更好的Q-Orbitrap分辨率可以達到140 000，Jia等應用UHPLC-Q-Orbitrap對鱸魚中的24種大環內酯類藥物及其代謝產物做定性定量檢測，其中確定限（CCα）為 0.12～3.61 μg/kg，檢測容量（CCβ）為0.20～6.02 μg/kg[32]，具體檢測結果見表1。

HRMS最初主要被應用于定性篩查研究中，目前隨著HRMS硬件的不斷進步，HRMS的分辨率和靈敏度得到提高，使基質干擾問題得以解決[5，64]，HRMS在全掃描模式下的選擇性與三重四級桿在選擇反應監測（selected reaction monitoring，SRM）模式下的選擇性一樣好，因此被越來越多地應用于獸藥定量研究中。4 數據分析

在LC-HRMS檢測動物源農產品獸藥殘留的研究中，根據研究目的不同，可分為靶向檢測數據處理和非靶向檢測數據處理。在靶向檢測研究中，數據處理步驟包括原始數據采集、生成參考數據庫（自建數據庫或在線數據庫）、化合物的分離鑒定、數據的標準化和量化、數據分析步驟一體化（自動處理工具）。其中，數據的采集主要采用儀器供應商提供的軟件[39-41，44]，如Thermo Fisher Scientific公司的Xcalibur軟件、Waters公司的MassLynx軟件、AB公司的Multiquant軟件、Agilent公司的Mass Hunter等，常用的數據處理軟件見表2。數據分析所用數據庫主要有2類，一類是由科研人員自己建立的數據庫，另一類是在線數據庫，如Chemspider、Metlin、Drug Bank等。通過搜索化合物的精確質量數，可以得到與之對應的化合物，但是存在以下問題：數據庫中所含化合物不夠全面;對給定的精確質量數不能提供準確的分子結構;或對同一精確質量數給出多個化合物。因此，須根據元素組成，對化合物分子式進行推斷，并結合特征碎片離子信息鑒定化合物，最后通過檢測標準品來確證。在使用數據處理軟件時，參數設置會影響研究結果，例如，若質量提取窗口設置范圍過寬，可能有假陽性檢出。為避免假陽性或假陰性，須要對質量提取窗口的寬度范圍進行試驗，如Jia等試驗了質量提取窗口設置成1～10 μg/kg時，數據處理軟件對羅非魚中獸藥及其代謝物的選擇性，發現當質量提取窗口為3 μg/kg時，目標分析物的提取效果最好[39]。

在動物源農產品的非靶向檢測研究中，數據分析步驟為原始數據采集、數據保存和轉化、數據導入、數據壓縮和矩陣建立、數據歸一化、特征檢測、生物標志物篩查、鑒定。多元統計分析方法如主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等可識別動物源樣品中的獸藥及其代謝產物，通用的商業軟件可能無法直接處理LC-HRMS檢測的原始數據，因此須要對原始數據進行格式轉換，轉換成開放性的數據格式之后便可進行數據處理[65-66]。近年來，隨著數據處理軟件的升級，自動化處理的程度越來越高。如Morales-Gutierrez等應用UPLC-LTQ-Qrbitrap MS檢測雞的肉、肝、腎中的阿莫西林及其代謝產物時，用PCA方法對數據進行處理，獲得了區分用藥組和非用藥組的化合物，試驗測得的原始數據首先經Xcalibur軟件轉化成mzXML文件，再用MzMine軟件和XCMS軟件來處理此數據，得到可以用Matlab處理的數據矩陣，最后用PCA法處理的數據矩陣，得到組間差異化合物[35]。而在Arias等用OPLS-DA模型識別用藥豬與未用藥豬之間差異的研究[67]中，數據前處理僅使用了TransOmics軟件[沃特世科技（上海）有限公司]，經歸一化、標準化的數據直接導入SIMCA軟件（德國賽多利斯集團）進行多元統計分析。自動處理軟件的開發，簡化了處理過程，縮短了處理時間。

5 展望

動物源農產品中的獸藥殘留直接危害公眾健康，因此受到消費者和監管部門的重視。高效準確地檢測動物源農產品中的獸藥殘留情況，對保證動物源農產品的質量安全具有重要意義。基于LC-HRMS的獸藥殘留檢測方法已經發展成為一項非常重要的檢測手段，綠色、高效的提取方法是未來 LC-HRMS 前處理方法的發展方向，色譜系統和色譜柱填料的進步，特別是將新型的色譜分離技術如nanoLC、μLC和CLC等與HRMS相結合是減少基質效應、提高分離效率的發展方向，HRMS分辨率的不斷提高以及應用軟件的優化會進一步促進LC-HRMS技術在動物源農產品獸藥殘留檢測中的應用研究。

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