蘇云金芽孢桿菌cry1Da5基因的克隆與表達

關鵬　秦培鋼　代小娟　宋金東

摘要：采用5對引物組合經2輪PCR擴增對蘇云金芽孢桿菌QL75-2菌株中的cry基因進行鑒定，克隆得到1個cry1Da型基因片段。通過設計全長引物擴增得到該cry基因的全長序列，轉入原核表達載體pET-28a中，在大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達，最后對表達蛋白進行生物活性分析。序列分析結果表明，該cry1Da基因全長3 495 bp，推測其編碼1 164個氨基酸，組成分子量約132.01 ku的蛋白質。該預測蛋白質與已知的Cry1Da3蛋白質具有最高的序列同源性（99.7%），該基因被國際殺蟲晶體蛋白基因命名委員會正式命名為cry1Da5。生物活性分析結果表明，Cry1Da5蛋白質對鱗翅目的甜菜夜蛾幼蟲具有較強的殺蟲活性，其LC50為21.47 μg/mL，而對鱗翅目的棉鈴蟲幼蟲無殺蟲活性。因此，cry1Da5基因可作為一個新的cry基因資源在甜菜夜蛾的生物防治中應用。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌;簡并引物;cry1Da5基因;棉鈴蟲;甜菜夜蛾;殺蟲活性

中圖分類號： S182

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0118-05

收稿日期：2018-10-26

作者簡介：關 鵬（1984—），男，陜西渭南人，博士，講師，主要從事微生物殺蟲劑研究。E-mail：guanpeng0719@163.com。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在芽孢形成過程中能夠產生形態多樣的伴胞晶體（又稱殺蟲晶體蛋白或 δ- 內毒素，由cry、cyt基因編碼），這些伴胞晶體對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、螨類、線蟲等農林及衛生害蟲具有特異性的殺蟲活性[1-2]，因此Bt菌株及其殺蟲基因被廣泛應用于農林、衛生害蟲的生物防治。

在已知的75類cry基因中，cry1類基因編碼蛋白主要對鱗翅目害蟲具有廣泛的殺蟲活性，然而不同的Cry1類蛋白存在不同的殺蟲譜。例如Cry1Ac和Cry1Ca對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲均有顯著的殺蟲活性[3-5];棉鈴象甲（Anthonomus grandis）和草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）幼蟲對Cry1Ia敏感[6];Cry1Ab和Cry1Fa主要對玉米螟（Corn bore）、草地夜蛾幼蟲具有較強的殺蟲活性[7];Cry1Da對甜菜夜蛾、小菜蛾（Plutella xylostella）等夜蛾科害蟲具有明顯的殺蟲活性[8-10]。

cry基因的鑒定多采用宋福平等建立的限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）基因鑒定體系[11]，通過對同一大類的不同cry基因進行序列比對，根據保守區域設計該類型cry基因的通用引物，然后利用PCR的方法對Bt菌株中的cry基因片段進行擴增，并采用不同的DNA內切酶對擴增產物進行雙酶切鑒定。本研究采用的是Berón等創建的一種新的cry基因鑒定方法[12]，首先對不同大類cry基因編碼蛋白質序列進行比對，得到蛋白質的保守區域，然后根據其對應的核酸序列，分別設計5條簡并引物，然后通過2輪PCR擴增，并結合測序方法對Bt QL75-2菌株中的cry基因進行鑒定、全長擴增及原核表達，并對表達產物進行殺蟲活性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 野生型蘇云金芽孢桿菌QL75-2菌株、大腸桿菌DH5α感受態細胞由筆者所在實驗室保存。

1.1.2 供試昆蟲 棉鈴蟲、甜菜夜蛾幼蟲為筆者所在實驗室飼養的標準化測試昆蟲。

1.1.3 培養基 LB（Luria-Bertani）液體培養基：稱取10 g蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母提取物，加無菌水定容至 1 000 mL;LB固體培養基：在LB液體培養基中加入1.5%瓊脂粉;1/2 LB液體培養基：將LB液體培養基中的各成分均減半后，加無菌水定容至1 000 mL;1/2 LB固體培養基：在1/2 LB液體培養基中加入1.5%瓊脂粉。將配制好的培養基置于121 ℃條件下高溫蒸汽滅菌20 min。

1.1.4 試劑 pMD19-T載體、T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司;DNA Marker、蛋白質Marker、氨芐青霉素、X-gal、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司;Axygen DNA凝膠回收試劑盒、Axygen質粒小量提取試劑盒購自上海百賽生物技術股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Bt質粒DNA的提取及cry基因的鑒定 采用 Reyes-Ramírez等的方法[13]提取Bt質粒DNA。cry基因的鑒定參考Berón等的方法[12]，首先以Bt QL75-2菌株質粒DNA為模板，使用OL1和OL5引物組合進行第1輪擴增，然后將擴增產物稀釋50倍后作為擴增模板，采用OL1-OL5、OL1-OL4、OL2-OL5、OL2-OL4、OL3-OL5等5對引物組合分別進行第2輪PCR擴增，引物序列見表1。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性45 s，40 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，循環35次;72 ℃ 延伸3 min。對擴增產物進行電泳檢測并回收，將回收產物送深圳華大基因科技有限公司進行測序。

1.2.2 cry基因的全長克隆及測序 利用NCBI BLASTx在線分析工具對“1.2.1”節中擴增得到的基因片段進行序列比對，根據比對結果，設計并合成cry基因全長擴增引物（正向引物cry1Da-F：5′-ATGGAGATAAATAATCAG-3′，反向引物cry1Da-R：5′-CTATTCCTCCATAAGGAG-3′）。將擴增產物與克隆載體pMD19-T連接，然后轉入大腸桿菌DH5α中，通過藍白斑篩選獲得陽性單克隆，最后對陽性單克隆中的插入基因序列進行測序分析。

1.2.3 cry1Da基因的序列分析 利用NCBI數據庫中的BLASTx工具對cry1Da基因序列進行同源性分析;采用Vector NTI Advance 11和DNAStar軟件對cry1Da基因及相似序列進行多序列比對;采用DNAMAN 6.0.40軟件選擇基因酶切位點，并對通過cry1Da基因預測的編碼蛋白質序列進行同源性分析。

1.2.4 cry1Da5基因的原核表達及檢測 根據大腸桿菌表達載體pET-28a的多克隆位點，使用DNAMAN 6.0.40軟件對cry1Da5基因序列進行酶切位點分析，設計并合成cry1Da5基因表達擴增引物，正向引物cry1Da5-F：5′-GCGTCGACATGGAGATAAATAATCAG-3′（下劃線部分為SalⅠ酶切位點），反向引物cry1Da5-R：5′-CCGCTCGAGCTATTCCTCCATAAGGAG-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點），使用高保真Pfu DNA聚合酶對Bt QL75-2菌株中的cry1Da5基因進行PCR擴增。擴增產物與pET-28a載體分別經過SalⅠ和XhoⅠ的雙酶切后，通過T4連接酶連接，獲得重組子pET-cry1Da5，將重組子轉入到大腸桿菌DH5α中;對陽性單克隆中的重組質粒進行酶切分析驗證;最后將重組質粒轉入到大腸桿菌BL21（DE3）中，加入 200 μL 1 μmol/mL IPTG溶液，在28 ℃，200 r/min 條件下誘導表達10 h。取少量培養產物用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白電泳檢測[14]。Cry1Da5表達蛋白的提取參考Schgger等的方法[15]。

1.2.5 Cry1Da5蛋白殺蟲活性的測定 將稱質量后的Cry1Da5表達蛋白加入到10 mL無菌水中，振蕩混勻制成懸液，采用梯度稀釋法將懸液濃度分別稀釋為5、10、20、40、80、160 μg/mL等，分別與適量養蟲飼料均勻混合，分裝于12孔培養板中。每孔放2頭二齡期棉鈴蟲或甜菜夜蛾幼蟲，每個濃度重復3次，將加無菌水的飼料作為空白對照，培養3～5 d后統計結果。采用SPSS 10.0軟件對統計結果進行分析并計算致死中濃度（LC50）。

2 結果與分析

2.1 Bt QL75-2菌株中cry基因的鑒定

DNA電泳結果（圖1）表明，5對引物組合均可擴增得到產物，其中OL1-OL5、OL2-OL5、OL3-OL5引物組合均擴增得到1個大小約500 bp的DNA片段;OL2-OL4引物組合擴增得到1個大小約750 bp的產物;OL1-OL4引物組合擴增得到1個大小約1.1 kb的DNA片段。對這些PCR產物進行測序分析，結果表明，OL1-OL4引物組合的擴增產物序列長1 126 bp，是與已知的cry1Da3基因序列同源性為99.8%的cry1Da型基因片段;而另外4對引物組合的擴增產物均非cry基因片段。

2.2 cry基因的全長克隆及其序列分析

利用引物cry1Da-F和cry1Da-R對“21”節中的cry1Da型基因的全長序列進行擴增，并對擴增產物進行電泳檢測，結果（圖2）表明，擴增得到1個長約3.5 kb的DNA序列。對該序列進行測序分析，生物信息學分析結果（圖3）表明，該基因序列全長3 495 bp，推測其編碼1 164個氨基酸（圖4），組成分子量約為132.01 ku的蛋白質，等電點為5.29。Cry1Da類蛋白質序列比對分析結果（表2）表明，本研究預測的Cry1Da蛋白質與其他已知的Cry1Da類蛋白質的氨基酸序列均存在差異，該蛋白質與已知的Cry1Da3蛋白質具有最高的序列同源性（997%），二者之間僅有4個氨基酸不同。根據國際Bt殺蟲晶體蛋白質基因的命名規則，該基因被正式命名為cry1Da5（GenBank登錄號為MG181949）。

2.3 cry1Da5基因的原核表達

表達產物的SDS-PAGE分析結果（圖5）表明，cry1Da5基因表達大小約130 ku的產物，這與預測的cry1Da5基因編碼的蛋白質分子量大小一致。

2.4 Bt QL75-2菌株的生物活性分析

生物活性測定分析結果（表3）表明，Cry1Da5蛋白質對鱗翅目的甜菜夜蛾幼蟲具有較明顯的殺蟲活性，其LC50為21.47 μg/mL，95%的置信區間為18.33～24.61 μg/mL;但是該蛋白質對棉鈴蟲幼蟲不具有殺蟲活性。

3 討論

本研究采用Berón等的方法[12]從Bt QL75-2菌株中鑒定得到1個cry1Da5基因，進一步驗證了該方法的可行性。該鑒定方法與宋福平等的方法[11]相比，其優點為：（1）合成引物少，節約引物合成的成本;（2）對于較多Bt菌株的鑒定，所進行的PCR擴增次數較少，且省去了雙酶切檢驗的過程;（3）采用簡并引物對cry基因進行鑒定，易得到新型基因。然而該方法也存在一些缺點，在PCR擴增中引物的錯配率較高，非目標產物較多，且PCR產物主要通過測序來驗證其正確性，導致測序成本較高。

生物活性分析結果表明，Cry1Da5蛋白質對甜菜夜蛾具有較強的殺蟲活性，另外，序列比對結果發現，Cry1Da5與Cry1Da3蛋白質的同源性最高，僅有4個氨基酸存在差異，而黃天培等研究發現，Cry1Da3蛋白質對甜菜夜蛾和小菜蛾均具有高效的殺蟲活性[16]，因此，上述研究結果均證實了Cry1Da類蛋白質主要對夜蛾科昆蟲具有特異性的殺蟲活性。

盡管cry基因被廣泛地應用于農林及衛生害蟲的生物防治，但是昆蟲的抗性問題一直是cry基因應用的一個瓶頸。近年來，新cry基因資源的不斷挖掘、不同cry基因的重組或協同表達成為解決昆蟲抗性問題的有效方法。因此，新發現的cry1Da5基因將作為新的備選基因在害蟲生物防治中被應用。

表2 Cry1Da與其他Cry1Da類蛋白質氨基酸序列間的差異性比較

名稱差異氨基酸數目（個）Cry1Da1Cry1Da2Cry1Da3Cry1Da4Cry1Da383846

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