3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化系統及組織結構的影響

鄧平　張立強　艾桃山　喻運珍　余少梅　羅楊志　鄭青

摘要：以平均體質量為（6.45±0.14） g克氏原螯蝦為研究對象，分別投喂含1%姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散的配合飼料，飼養42 d后檢測并比較不同中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化應激指標和組織結構的影響。結果表明，3種中草藥均顯著提高了克氏原螯蝦肝胰腺SOD和CAT活性，其中姜黃素對CAT活性的促進作用更顯著;3種中草藥均明顯降低了肝胰腺的MDA含量，但對GSH-Px活性無顯著影響。組織學觀察發現3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺未造成明顯損失。由此可見，飼料中添加1%劑量的3種中草藥可明顯增強克氏原螯蝦肝胰腺的抗氧化能力，且安全可靠。

關鍵詞：克氏原螯蝦;肝胰腺;抗氧化;組織結構;中草藥

中圖分類號： S942.1;S942.2+6

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0183-05

收稿日期：2018-10-31

作者簡介：鄧 平（1979—），女，湖北枝江人，博士，工程師，主要從事水產養殖生態學研究。E-mail：sssdp@126.com。

通信作者：張立強，博士，高級工程師，主要從事魚類病害研究。E-mail：280585404@qq.com。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱小龍蝦，是中國淡水蝦類中的重要資源[1]。其肉味鮮美、營養豐富，深受廣大消費者喜愛，成為國內廣泛養殖的一種重要經濟水生動物[2]。隨著克氏原螯蝦集約化養殖規模的擴大，病害問題日趨嚴重[3]，而抗生素等化學藥物的濫用不僅會造成致病菌多重抗藥性，還會引發藥物殘留等問題，危害環境和食品安全。因此，尋求綠色環保、安全高效的免疫強劑對克氏原螯蝦養殖產業的可持續發展具有重要意義。

目前，有關中草藥促進甲殼動物非特異免疫功能的報道已見于克氏原螯蝦[4]、凡納濱對蝦[5-6]、羅氏沼蝦[7]、斑節對蝦[8]、中華絨螯蟹[9]等。姜黃素、肝膽利康散和穿梅三黃散具有保肝護肝作用，姜黃素和肝膽利康散還能提高水產養殖動物肝胰臟的抗氧化能力[10-12]，而3種中草藥對克氏原螯蝦的肝胰腺是否具有保護作用還未見報道。本試驗通過連續投喂3種中草藥制劑姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散42 d，研究克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化應激指標[包括超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量]的變化及對肝胰腺組織結構的影響，探討中草藥的作用機理，為中草藥在克氏原螯蝦飼料中的合理應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料的制備本試驗選取姜黃素、肝膽利康散（武漢中博水產生物技術有限公司提供成品，主要有茵陳、大黃、郁金、連翹、柴胡）、穿梅三黃散（武漢中博水產生物技術有限公司提供成品，主要有大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅）為試驗原料，按1%比例加入飼料，攪拌加水混勻，4 ℃冰箱保存備用。飼料的主要營養成分包括粗蛋白28.0%、粗脂肪4.0%、粗纖維10.0%、粗灰分12.0%、水分13.0%、鈣0.6%、磷0.9%。

1.2 試驗蝦的飼養與管理

試驗蝦取自武漢市農業科學院水產研究所山坡基地養殖場，在武漢中博水產生物技術有限公司養魚房進行試驗。將克氏原螯蝦暫養7 d后，分成對照組和3個試驗組（姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散），每組設置3個平行，每組投放10尾克氏原螯蝦，養殖在50 L水族箱中。水族箱底放置PVC管，供克氏原螯蝦蛻皮隱蔽用。每天投喂蝦飼料1次，投喂量為蝦體質量的3%～5%，次日投喂飼料前采用虹吸管吸出殘餌與糞便并換水1/3，以保證水質清潔。試驗周期為6周。

1.3 肝胰腺免疫酶學指標的測定及切片

分別于養殖42 d后從每個平行組隨機取5尾活體進行解剖，剖取的肝胰腺組織用生理鹽水漂洗后，一部分置于 -20 ℃ 冰箱冷凍保存，肝胰腺中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA、總蛋白（TP）含量均采用相應的試劑盒檢測。

另取一部分肝胰腺組織用4%中性甲醛固定，經洗滌、脫水、透明、滲透和包埋后，切成厚度為 5 μm 的薄片，HE染色，再經脫水和透明后用中性樹膠封片，光鏡下觀察組織學特征。

1.4 統計分析

不同中草藥對克氏原螯蝦胰腺免疫酶學指標的影響采用單因素方差分析（A-NOVA）進行分析（SPSS 19.0，P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 3種中草藥制劑對肝胰腺抗氧化指標的影響由3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影響（圖1）可知，與對照組相比，養殖42 d各添加組均能顯著提高克氏原螯蝦肝胰腺SOD活性（P<0.05），但各添加組間無顯著性差異（P>0.05）。各添加組克氏原螯蝦肝胰腺CAT活性均較對照組高（P<0.05），且各添加組間差異顯著（P<0.05），姜黃素組克氏原螯蝦肝胰腺CAT活性最高。各添加組克氏原螯蝦肝胰腺的GSH-Px活性與對照組之間無明顯差異（P>0.05）。與對照組相比，3種中草藥均能顯著降低克氏原螯蝦肝胰腺MDA含量（P<0.05），但各添加組間無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 3種中草藥制劑對肝胰腺組織結構的影響

連續投喂中草藥42 d后解剖克氏原螯蝦的肝胰腺進行HE染色，結果如圖2所示。與沒有投喂中草藥的空白對照組相比，中草藥各組的肝胰腺結構基本無損，肝小體排列整齊，基膜完整，肝小管呈星形，肝小體細胞排列緊湊無散落;肝小體間隙的血細胞無明顯變化（100×）。空白組和3種中草藥組肝小體細胞層的分泌細胞（B細胞）和吸收細胞（R細胞）均完整，R細胞無明顯增多，部分B細胞體積有一定的增大（400×）。組織學觀察發現，克氏原螯蝦用1%劑量的中草藥是安全的，對肝胰腺組織結構不會產生明顯損傷。

3 討論與結論

3.1 3種中草藥制劑對肝胰腺抗氧化指標的影響

肝胰腺是甲殼動物最主要的免疫器官，其SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量等與多種生理代謝和免疫反應有關，能綜合反映甲殼動物的抗氧化防御系統功能[13-14]。

SOD和CAT是生物體內抗氧化防御功能的關鍵酶，它們能有效地清除活性氧自由基，減少脂質過氧化損傷。關于姜黃素提高水產養殖動物肝胰臟抗氧化能力已有較多報道，張滕閑等以姜黃素投喂黃顙魚，肝胰臟SOD和CAT活性均顯著提高[15];余少梅等用姜黃素投喂肝損傷的草魚，能明顯增強草魚肝臟的SOD和CAT活性[12]。肝膽利康散對水產養殖動物脂肪肝有治療作用[11]，也有關于提高肝損傷草魚肝臟SOD和CAT活性的報道[12]。穿梅三黃散具有殺菌和輔助肝損傷修復的作用，其主要成分大黃、黃芪等，能明顯促進羅氏沼蝦、凡納濱對蝦和克氏原螯蝦肝胰腺的SOD和CAT活性[14，16-17]，而復方中草藥制劑穿梅三黃散對水產養殖動物非特異性免疫方面的研究還未見報道。本試驗中分別以1%姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散飼養克氏原螯蝦42 d，其肝胰腺SOD和CAT活性均明顯升高，其中3種中草藥添加組SOD活性差異不顯著，而3種中草藥對CAT活性影響差異顯著，以姜黃素對CAT活性促進作用更明顯。該結果表明，3種中草藥對克氏原螯蝦抗氧化系統的SOD與CAT協同發揮作用，而姜黃素作用于CAT的效果更強。

GSH-Px能幫助機體保持正常的免疫系統功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。3種中草藥（或主要成分）對水產養殖動物GSH-Px活性的影響不盡相同，姜黃素可顯著提高肝損傷草魚、黃顙魚和奧尼羅非魚肝胰臟的GSH-Px活性，但降低了大菱鲆幼魚血清中的GSH-Px活性[12，15，18-19]。肝膽利康散提高了肝損傷草魚肝臟的GSH-Px活性[12]。大黃素可明顯提高克氏原螯蝦肝胰腺 GSH-Px 活性[17]。本試驗中3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺GSH-Px活性無顯著激活作用，可能與3種中草藥對克氏原螯蝦抗氧化酶的促進作用和酶的種類有關。

MDA是最重要的脂質過氧化產物，它的含量反映了細胞受損傷的程度和脂質過氧化程度，從而間接反映體內活性氧的積累情況[20]。本研究中3種中草藥添加組克氏原螯蝦肝胰腺的MDA含量明顯降低，說明飼喂3種中草藥的克氏原螯蝦機體抗氧化系統在此時能夠對生成的氧自由基進行及時清除，脂質過氧化反應的水平較低。這與3種中草藥（或主要成分）對草魚、凡納濱對蝦及克氏原螯蝦等水產養殖動物的研究結果[12，16-17]一致。

3.2 3種中草藥制劑對肝胰腺組織結構的影響

克氏原螯蝦肝胰腺和其他甲殼動物一樣，肝小體是其結構和功能的基本單位[21]。肝小體主要由基膜、細胞層和肝小管組成，細胞層中的細胞可分為分泌細胞（B細胞）、存儲細胞（R細胞）、纖維細胞（F細胞）和胚細胞（E細胞），其中B細胞和R細胞數量較多[22]。在本試驗采樣過程中發現，投喂中草藥的克氏原螯蝦肝胰腺色澤紅潤。肝胰腺組織切片HE染色后，投喂姜黃素、肝膽利康散、穿梅三黃散的克氏原螯蝦肝胰腺組織結構無顯著病理變化。盧婉怡也有研究表明，灌喂高劑量的姜黃素未引起奧利羅非魚肝胰腺的病理變化[19]。姜黃素和肝膽利康散還可改善肝損傷草魚肝組織的病理變化[12]，而連續投喂含烏梅的復方中草藥對凡納濱對蝦的肝胰腺沒有產生損害[23]。這說明本試驗所用的3種中草藥對克氏原螯蝦肝胰腺組織不會產生明顯損傷。

綜上所述，在飼料中投喂3種中草藥均增強了克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化功能，并且對機體沒有損傷，因此具有良好的應用前景。

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