益氣溫陽、活血化瘀方對(duì)慢性病毒性心肌炎模型小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響1)

楊 穎,白曉秋,田 源

病毒性心肌炎(VMC)發(fā)病在我國(guó)乃至世界呈上升趨勢(shì)[1]。病毒性心肌炎是以心肌組織大量單核細(xì)胞浸潤(rùn),出現(xiàn)灶性壞死及纖維化等病理改變?yōu)樘卣鞯囊环N病毒引起的免疫性疾病[2]。近年來,發(fā)現(xiàn)多種病毒可以促發(fā)心肌細(xì)胞凋亡,心肌細(xì)胞凋亡可能是病毒性心肌炎向擴(kuò)張型心肌病演變的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)通過多次腹腔接種柯薩奇B3m病毒稀釋液方式建立重復(fù)感染的VMC動(dòng)物模型,通過對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平測(cè)定,探討益氣溫陽活血化瘀方防治慢性病毒性心肌炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病毒 雄性BALB/c小鼠120只,(3～4)周齡,購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(軍)]。柯薩奇B3m病毒(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)克山病研究所提供),在Hela細(xì)胞中傳代,凍融 3次,離心(2 000 r/min)10次,上清液分裝,在Hela細(xì)胞中測(cè)50%組織感染率(TCID)為10-7,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)用藥 益氣溫陽、活血化瘀方由黃芪、人參、肉桂、附子、川芎、丹參、大青葉等組成。中藥經(jīng)水提取,制成浸膏,含水量為21%。用蒸餾水稀釋,調(diào)整濃度為82%,即相當(dāng)于1 mL懸液中含生藥4.3 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供。

1.3 動(dòng)物模型的復(fù)制及分組 小鼠慢性病毒性心肌炎模型的復(fù)制,分別于 1 d、8 d、15 d、22 d、36 d、50 d 6 次經(jīng)小鼠腹腔接種柯薩奇B3m病毒稀釋液接種病毒。空白組于實(shí)驗(yàn)相同時(shí)點(diǎn)給予同體積的RM1640液。試驗(yàn)分組,分別將存活慢性病毒性心肌炎小鼠120只,隨機(jī)分為模型組、空白組、中藥組,每組40只。

給藥方法,中藥組及西藥組于末次病毒感染后10 d灌胃,中藥組予益氣溫陽 、活血化瘀方混懸液10.35 g/(kg?d)灌胃,空白組和模型組灌胃同體積生理鹽水。每日1次灌胃4周。全部灌胃結(jié)束后模型組剩余33只,中藥組剩余39只,空白組剩余38只。

1.4 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 應(yīng)用DNA原位缺口末端標(biāo)記法(T UNEL)檢測(cè)。石蠟組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟脫水后,用蛋白酶K(Roche)室溫孵育30 min,PBS洗片后與0.3%過氧化氫甲醇溶液室溫孵育30 min,PBS沖洗2次,加入 TUNEL反應(yīng)混合液在濕盒中37℃室溫孵育60 min,PBS沖洗3次,蘇木精復(fù)染,脫水透明,中性樹膠封片。每張切片于400倍光鏡下,計(jì)數(shù)呈棕黃色的T LNEL陽性細(xì)胞核以及所有細(xì)胞核。心肌細(xì)胞凋亡情況以Motic Images Aovancel 3.2圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)的平均光密度和目標(biāo)總面積占選區(qū)的百分比表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組均數(shù)間的比較應(yīng)用方差分析,兩兩比較應(yīng)用 q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織病理形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變 大體外觀小鼠心臟解剖,肉眼可見接種病毒后的兩組小鼠心肌表面分布著許多灰白色點(diǎn)狀、絮狀或條狀物。心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變,空白組HE染色可見心肌纖維排列整齊,間質(zhì)血管無改變,未見心肌細(xì)胞變性、壞死;VG染色可見極纖細(xì)的膠原纖維。模型組HE染色可見心肌纖維排列紊亂、斷裂,心肌細(xì)胞肥大,空泡變性,血管充血出血,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)纖維化明顯。VG染色可見大量的膠原纖維。中藥組HE染色可見心肌纖維排列紊亂較輕微,未見心肌斷裂,血管充血出血,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),間質(zhì)纖維化程度輕微。VG染色可見血管間質(zhì)有少量膠原纖維聚集。

心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變,空白組小鼠肌纖維走行規(guī)則,M線Z線清晰可見,線粒體結(jié)構(gòu)清晰,間質(zhì)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)正常。模型組小鼠心肌細(xì)胞核變大,可見雙核仁,核膜明顯不規(guī)則,線粒體明顯增多,線粒體嵴融合,肌絲溶解、斷裂,M 線消失,間質(zhì)膠原纖維增生明顯,間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生活躍。中藥組小鼠心肌肌纖維走行基本規(guī)則,線粒體輕度增生,間質(zhì)膠原纖維增生不明顯。

2.2 益氣溫陽,活血化瘀方對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 與空白組相比,各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,中藥組心肌細(xì)胞凋亡明顯受到抑制(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡光密度及凋亡目標(biāo)總面積占選區(qū)面積的比較(±s)

表1 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡光密度及凋亡目標(biāo)總面積占選區(qū)面積的比較(±s)

組別 n 光密度 面積(μ m2)空白組 38 0.301 9±0.125 0 4.277 4±0.140 3模型組 33 0.373 6±0.164 21) 10.160 0±1.219 21)中藥組 39 0.325 3±0.078 11)2) 6.607 6±0.195 61)2)與空白組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05

3 討 論

對(duì)于慢性病毒性心肌炎,目前認(rèn)為它多發(fā)生在急性、重癥心肌炎后,以斑痕組織為主要病理表現(xiàn)的心肌病變,另外病毒的持續(xù)作用及自身免疫機(jī)制引起的心肌反復(fù)損傷也可致慢性VMC。心肌細(xì)胞凋亡是慢性病毒性心肌炎心肌細(xì)胞表達(dá)凋亡的相關(guān)蛋白。在病毒性心肌炎發(fā)病過程中,多種調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因及蛋白質(zhì)分子的表達(dá)水平明顯增高現(xiàn)象,提示在病毒性心肌炎的病理生理發(fā)展過程中,存在凋亡所造成的對(duì)心肌細(xì)胞的損傷,但凋亡的機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。通過抑制心肌細(xì)胞凋亡,減少心肌細(xì)胞壞死。隨病程的遷延心肌細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)增加趨勢(shì),在慢性VMC,發(fā)生明顯心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。目前研究表明在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,細(xì)胞凋亡起重要的作用。細(xì)胞不斷凋亡,導(dǎo)致心肌細(xì)胞不斷丟失,最終導(dǎo)致心功能障礙的重要因素。

本實(shí)驗(yàn)用DNA原位缺口末端標(biāo)記法觀察心肌細(xì)胞的病理變化及心肌細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組未見凋亡心肌細(xì)胞,模型對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡顯著增加,表明細(xì)胞凋亡參與了慢性VMC的發(fā)生發(fā)展過程,中藥組心肌細(xì)胞凋亡明顯減少。凋亡的心肌細(xì)胞多呈散在分布,非壞死區(qū)域也發(fā)現(xiàn)單個(gè)心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)觀察益氣溫陽,活血化瘀方對(duì)慢性期VMC小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,模型組心肌細(xì)胞凋亡明顯高于空白組(P＜0.05),中藥組心肌細(xì)胞凋亡較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05),說明益氣溫陽,活血化瘀方具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。

[1]胡大一,許玉韻.循證心血管病學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,1995:5.