慢性阻塞性肺疾病腸道微生態與炎癥因子及臨床指標的相關性

吳永紅 陳軍 羅洲

四川省簡陽市人民醫院1重癥醫學科，2呼吸內科（四川簡陽641400）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo?nary disease，COPD，簡稱慢阻肺）是一種嚴重危及人類健康的慢性疾病，2018年中國40歲以上的成人慢阻肺的患病率高達13.7%，為主要醫療負擔之一［1］。目前普遍認為COPD的主要病理基礎是慢性非特異性炎癥，炎癥細胞及細胞因子在其中起著重要作用［2］。腸道菌群是近年研究的熱點內容之一，目前逐漸認識到腸道微生態失衡可能與COPD慢性氣道炎癥間存在密切關聯［3］。本研究旨在進一步明確COPD腸道微生態的多樣性與慢性氣道炎癥的相關性，為COPD防控提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2018年2月至2019年4月在我院呼吸內科病房或門診新入院未治療的慢阻肺急性加重患者（A組）30例，慢阻肺穩定期（S組）30例，并在我院體檢中心選取正常人對照組（N組）30例。所有入選患者均要求近4周未使用過抗生素和激素，且無腸道疾病。

1.1.1 納入標準 （1）年齡18～80歲；（2）COPD診斷標準均符合2018年中華醫學會呼吸病學會制定的COPD診斷標準［1］；（3）呼吸內科病房或門診新來院尚未開始治療的慢阻肺加重期患者及穩定期患者。

1.1.2 排除標準 （1）惡性腫瘤；（2）活動性結核；（3）其他的呼吸道疾病；（4）腸道疾病的患者；（5）妊娠期哺乳期婦女；（6）病情危重，需要氣管插管機械通氣患者；（7）合并多種疾病，病情不穩定患者；（8）其他原因不能配合本研究者。正常對照組為來自我院體檢中心近4周未使用過抗生素與激素的無肺部感染性疾病和腸道疾病的健康體檢人員。本研究經患者本人及家屬知情并簽字同意，醫院倫理委員會批準通過。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 所有入選患者均詢問病史及查體，行實驗室檢查及肺功能檢查。一般資料的指標有：性別、年齡、體質量指數（body mass index，BMI）、吸煙指數（包年）、COPD癥狀評分（COPD assessment test，CAT）［4］；實驗室檢查指標有：血常規、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C反應蛋白（C?reactive protein，CRP）等。肺功能檢查采用德國Jaeger公司肺功能儀，測定第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 s，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）和一秒率（forced expiratory volume in 1 s/forced vital capacity，FEV1/FVC）：測定時間均在早上8：00-12：00進行。測定方法參考中華醫學會發布的肺功能指南的程序和標準［5］。

1.2.2 糞便標本的收集與保存 患者來院24 h內留取新鮮糞便標本，厭氧低溫保存后轉移至實驗-80℃冰箱保存，直至使用糞便DNA微型試劑盒（MOBIO Laboratories）提取來自糞便樣品的DNA。

1.2.3 血清炎癥因子的測定 在開始治療前清晨采集所有患者空腹靜脈血5 mL，分離血漿，置于-20℃冰箱中凍存。采用ELISA法檢測血漿中腫瘤壞死因子α（TNF?α）、白介素（IL?6）及白介素-8（IL?8）水平，試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，具體步驟依據試劑盒說明書進行。

1.2.4 糞便中DNA提取和測序 抽提糞便中的DNA后用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，進行PCR擴增。細菌多樣性鑒定對應區域：16S V3?V4區（引物343F和798R）343F前端引物：5′?TACGGRAGGCAGCAG?3′；后端引物：798R?5′?AGGGTATCTAATCCT?3′，對V3?V4可變區進行PCR擴增，Qubit檢測對PCR產物定量。純化后產物送上海歐易公司測序，由Illumina Miseq測序。

1.2.5 生物信息學分析 使用Trimmomatic軟件［6］對原始雙端序列進行去雜，采用Vsearch軟件［7］，對參數為序列相似度≥97%被歸為一個操作分類單元（operational Taxonomic Unit，OTU）。使用QIIME軟件包的挑選出各個OTU的代表序列，并將所有代表序列與Silva（version123）數據庫進行比對注釋［8］。用組間差異顯著物種分析（LEfSe）軟件［9］，確定組間相對豐度差異的菌群。用冗余分析（redundancy analysis，RDA）方法，找出差異菌群與炎癥因子及臨床指標的相關性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。重復測量方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，正態分布數據用表示，用Spearman進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 本研究共納入A組、S組、N組患者各30例，最后完成實驗且標本合格者80例，其中A組29例，S組29例，N組22例。A組與S組患者在年齡、性別、吸煙指數、CAT指數、肺功能指標等臨床指標上基線一致，差異無統計學意義（P>0.05）。而BMI、嚴重程度分級、炎性指標差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 血清炎癥因子指標比較及相關性分析

2.2.1 3組患者血清炎癥因子水平 IL?8，TNF?α與IL?6差異有統計學意義，其中A組患者高于S組，且均高于N組，見表2。

2.2.2 相關性分析 IL?8、IL?6與TNF?α三者之間呈正相關（r=0.748、0.591、0.753，P<0.05），且炎癥指標與CAP評分、疾病嚴重程度分級與肺功能均存在相關性，見表3。

2.3 3組患者腸道菌群LEfSe分析 該分析主要是找到組間在豐度上有顯著差異的物種，不同顏色表示不同分組，可以觀察3組中存在顯著差異的物種，見圖1。

2.4 菌群相對豐度與炎癥指標相關性分析

2.4.1 A組患者腸道菌群相對豐度與炎癥指標的相關性分析 在A組患者中，霍氏真桿菌、厭氧棒狀菌屬、毛螺旋菌屬、雙歧桿菌、布勞特氏菌屬、柯林斯菌屬、Subdoligranulum菌與TNF?α、IL?8、IL?6、CAT評分和嚴重程度分級均呈負相關，但與FEV1%呈正相關。相反，普雷沃菌屬-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌和副擬桿菌則與炎性因子、CAT評分、嚴重程度分級呈正相關，而與FEV1%呈負相關，見表4。

表1 兩組患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups ±s

表1 兩組患者臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between the two groups ±s

臨床指標性別［男（%）］年齡（歲）吸煙指數（包/年）BMI（kg/㎡）WBC（×109/L）NEU（%）GOLD分級［例（%）］1級2級3級4級CAT評分FEV1%FEV1/FVC PO2（kPa）PCO2（kPa）PCT（pg/mL）CRP（mg/L）A組（n=29）17（58.61）64.14±8.04 18.07±13.24 21.47±1.46 8.53±2.43 73.72±10.18 0（0）16（55.17）7（24.14）6（20.69）19.58±6.22 46.73±13.83 54.28±11.47 10.01±2.79 6.16±2.42 0.28±0.51 48.37±66.12 S組（n=29）18（62.08）64.93±8.42 19.24±13.61 22.69±1.43 6.48±1.59 68.42±4.68 0（0）17（58.62）4（13.79）8（27.59）18.54±6.58 50.42±15.27 55.08±11.29 9.68±1.83 5.96±1.19 0.07±0.04 12.48±11.17 t/χ2值0.827 0.793 0.621 1.318 2.057 5.31 88.6 0.616 3.65 1.60 0.427 0.126 5.439 8.969 P值0.658 0.779 0.431 0.001<0.001 0.005<0.001 0.436 0.263 0.537 0.46 0.75 0.006<0.001

表2 3組患者血清炎癥因子指標比較Tab.2 Comparison of serum inflammatory factors among the three groups ±s

表2 3組患者血清炎癥因子指標比較Tab.2 Comparison of serum inflammatory factors among the three groups ±s

組別A組S組N組F值P值例數29 29 22 IL?8（pg/mL）60.96±26.80 41.33±9.76 30.13±5.89 24.972<0.001 IL?6（pg/mL）55.90±32.70 41.65±17.69 11.82±5.07 31.276<0.001 TNF?α（pg/mL）31.22±11.46 24.92±7.97 11.12±4.41 42.923<0.001

表3 血清炎癥因子與臨床指標的相關性分析Tab.3 The relativity analysis of serum inflammatory factors and clinical indicators

圖1 LEfSe分析差異物種注釋分支例圖Fig.1 Example diagram of annotation branches for LEfSe analysis of different species

表4 A組患者腸道菌群相對豐度與炎癥指標相關系數Tab.4 Correlation analysis between the abundance of intestinal flora and inflammatory indicators in group A

2.4.2 S組患者腸道菌群相對豐度與炎癥指標的相關性分析 在S組患者中，雙歧桿菌和Fusi?catenibacter菌豐度與IL?8水平呈負相關，Lachno?clostridium菌的豐度與IL?8及TNF?α水平均呈正相關，雙歧桿菌與CAT評分呈負相關，與FEV1%呈正相關；雙歧桿菌、Anaerostipes菌和Fusicateni?bacter與BMI呈正相關，見表5。

2.4.3 N組患者腸道菌群相對豐度與炎癥指標的相關性分析 在N組患者中，霍氏真桿菌豐度與患者CAT評分呈負相關，與FEV1%呈正相關；羅斯氏菌豐度與IL?8水平及嚴重程度呈負相關，Fu?sicatenibacter菌的豐度與TNF?α水平均呈正相關，見表6。

表5 S組患者腸道菌群相對豐度與臨床指標及炎癥因子的相關系數Tab.5 Correlation analysis between the abundance of intestinal flora and inflammatory indicators in group S

表6 N組患者腸道菌群相對豐度與臨床指標及炎癥因子的相關系數Tab.6 Correlation analysis between the abundance of intestinal flora and inflammatory indicators in group N

3 討論

慢阻肺是一種由多種炎癥細胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病，穩定期COPD患者仍然存在氣道和全身的慢性炎癥反應［1-2］。在COPD發病機制中，TNF?α、IL?8、IL?6是重要的致炎因子，通過誘導巨噬細胞、中性粒細胞聚集、黏附及脫顆粒，激化氧化應激反應的發生，參與或加重COPD氣道炎癥反應過程［10-11］。腸道菌群微生態失衡引起的內毒素及炎性介質釋放，直接或間接促進COPD的發生發展。腸道和肺部通過微生物、免疫功能相互影響，實現雙向調節，稱為腸-肺軸［12］。肺與腸存在相同的結構來源，哺乳動物肺上皮起源于胚胎腸內胚層，是從前腸內胚層的共同的祖先細胞衍生而來［13］。而且，腸源性有害因素是通過腸道到達肺部和全身循環淋巴管［14］。而腸道益生菌則可能改善COPD病理改變。HERB等［15］研究證明，短雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌可以改變COPD模型小鼠肺部病理特征，降低巨噬細胞的炎癥反應［16］。另有研究發現，攝入能夠增加短鏈脂肪酸生成的膳食可以預防彈性蛋白酶誘導的炎癥和肺氣腫的出現［17］。由上可知，腸道微生態與肺部之間可能通過代謝及免疫調節等信號通路相互影響［18］。

本研究中慢阻肺急性加重期患者的TNF?α，IL?8，IL?6高于穩定期患者，且均高于正常對照，表明COPD患者存在明顯的炎癥反應，炎癥因子可能參與了COPD發病及發展過程。IL?8、IL?6、TNF?α三者間存在正相關，說明炎癥因子的升高可能觸發級聯反應，啟動炎癥反應及刺激其他炎癥介質［19］，因此血清中的多種炎癥因子均會出現異常升高。炎癥因子升高與患者的嚴重程度和CAP評分存在正相關，與肺功能指標呈負相關，說明炎癥因子的升高可能產生對氣道、肺泡壁和肺血管的慢性損傷［20］，從而引起氣流受限，提示炎癥因子對于判斷和預測COPD急性加重及病情的嚴重程度均有一定的價值。

本研究中3組患者腸道菌群存在明顯差異，用LEfSe分析進一步確定組間在豐度上有顯著差異的物種，A組差異的物種有擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、變形菌、腸球菌、普雷沃氏菌科；S組有差異的物種有：放線菌門、雙歧桿菌屬；N組有差異的物種有綠菌門、毛螺菌屬、厚壁菌門、布勞特氏菌等。提示這些差異物種可能可作為慢阻肺分期的生物標志物。差異菌與炎癥因子及臨床指標的相關性分析結果顯示，在慢阻肺急性加重期患者中，霍氏真桿菌、Anaerostipes菌、毛螺旋菌屬、雙歧桿菌、布勞特氏菌屬、柯林斯菌屬、Subdoligranulum菌與炎癥因子、CAP評分及嚴重程度呈負相關，與肺功能指標FEV1%呈正相關，而普雷沃菌屬-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌和副擬桿菌卻恰好相反。霍氏真桿菌、Anaerostipes菌、雙歧桿菌等可產生豐富的短鏈脂肪酸，維護腸黏膜免疫系統的平衡，抑制炎癥因子，減輕慢阻肺患者的慢性炎癥損傷，從而改善患者的臨床癥狀與肺功能［21］。普雷沃菌屬-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌和副擬桿菌等豐度的升高引起炎癥因子的高表達，從而促進慢阻肺的發生發展。在穩定期的慢阻肺患者及正常對照組中，菌群的豐度與炎癥因子及臨床指標的相關性較弱，雙歧桿菌、Fusicatenibacter菌與羅斯氏菌與氣道炎癥因子呈負相關，而與FEV1呈正相關，而Lachnoclostridium菌則同樣得出相反的結果。進一步提示霍氏真桿菌、雙歧桿菌、布勞特氏菌屬等菌種可能減輕慢阻肺患者氣道炎癥，而普雷沃菌-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌等則可能引起炎癥因子升高，而與慢阻肺急性加重和臨床指標的惡化有關。

綜上所述，本研究揭示了慢阻肺患者在不同時期腸道微生態和炎癥因子的變化，以及微生態與炎癥因子及臨床指標的相關性，找出不同分期存在的差異菌群。提示有些菌群，如霍氏真桿菌，Anaerostipes菌，毛螺旋菌屬，雙歧桿菌等可抑制慢阻肺的慢性炎癥，或許可作為慢阻肺患者的有益菌；而普雷沃菌屬-9、腸球菌、Lachnoclostridium菌和副擬桿菌等則與炎癥因子高表達有關，可能促進慢阻肺的發生與進展。隨著高通量測序技術進一步發展，通過改變腸道不同菌群的豐度，對慢阻肺的發生發展及急性加重的預防進行調控，可能可作為下一步的研究方向。本研究存在以下不足：腸道菌群影響因素多，研究結果可能會受到混雜因素的影響；樣本量少；研究的菌種尚有限。以后尚需開展大規模的更精準的研究才能提供更多的證據。