通過生物信息學分析確定結直腸癌肝轉移的樞紐基因

劉義，朱亞珍，韋成江，馮雁，林源★

（1.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科，廣西 南寧；2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部，廣西 南寧）

0 引言

結直腸癌（CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一[1]。盡管在過去的幾十年中診斷方法和綜合治療得到不斷改善，但CRC 的死亡率在中國癌癥死亡率仍然排名第五[2]。CRC 的肝臟轉移是最常見的轉移部位。據(jù)估計，在初次診斷時就已發(fā)現(xiàn)有15 - 25%的結直腸癌患者同時存在肝轉移。結直腸癌肝轉移提示癌癥患者預后不良。肝轉移CRC 患者的5 年總體生存率只有25 40%，明顯低于無肝轉移的患者（69.5-95.7%）[3]。因此，確定其轉移發(fā)生的分子學機制對結直腸癌肝轉移的診療策略具有重要的臨床意義。

加權共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）可以作為數(shù)據(jù)挖掘工具或基因篩選方法來發(fā)現(xiàn)高度相關基因的簇（模塊）。它被廣泛用于在各種癌癥中尋找中樞基因。例如，Colin 等人使用WGCNA 和UBE2S 從大規(guī)模乳腺癌數(shù)據(jù)中識別了11 個基因共表達簇，這可能表明乳腺癌預后較差[4]。

本研究了使用該算法來識別與肝轉移特征相關的網(wǎng)絡樞紐基因（hubgene），挖掘結直腸癌肝轉移過程中的關鍵基因及調控網(wǎng)絡。

1 材料和方法

1.1 納入芯片

通過檢索GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫，關鍵詞設置為“colorectalcancer，gene expression，microarray”，選取了編號GSE41258 的芯片數(shù)據(jù)集。該芯片基于GPL96 平臺，包含結直腸癌原發(fā)灶、轉移灶和正常結腸組織共390 例樣本。根據(jù)我們的研究目的，挑選其中47 例結直腸癌肝轉移灶和186 例原發(fā)灶的原始芯片數(shù)據(jù)。使用R 軟件的Affy 包讀取數(shù)據(jù)并使用RMA算法對表達數(shù)據(jù)進行預處理，得到標準化以后的基因表達矩陣。

1.2 共表達網(wǎng)絡的構建

使用R 軟件的WGCNA 包，選取方差位于前25%的基因構建共表達網(wǎng)絡。然后對基因進行Pearson 相關矩陣分析，并計算確定β 值，建立無尺度網(wǎng)絡，再將鄰接轉化為拓撲重疊矩陣（TOM），通過層次聚類，將相關性較高的至少30 個基因分成不同模塊。計算模塊特征基因的差異性，并合并了相關性高的模塊。最后計算基因顯著性（GS）、基因模塊身份（MM）以識別臨床特征和基因的相關性，篩選出重要的模塊和基因。

1.3 樞紐基因篩選及（protein-protein interaction）PPI 分析

選取候選模塊中相關性高的基因，即連接度排在前10%的基因且滿足必須滿足|MM|＞0.80 和|GS|＞0.20，兩者取交集，即為關鍵候選樞紐基因上傳至String（https：//string-db.org/）網(wǎng)站構建PPI 網(wǎng)絡，并使用Cytoscape 軟件進行可視化篩選。

1.4 樞紐基因在原發(fā)灶和肝轉移灶中的表達差異分析

提取GSE41258 中的樞紐基因表達量和組織類型數(shù)據(jù)，用t 檢驗探索樞紐基因在兩種組織中的表達差異。并繪制ROC 曲線，通過ROC 曲線下面積（AUC）識別樞紐基因對兩種組織的診斷能力，AUC＞0.7 認為有較高的準確性，提示潛在的診斷價值。

1.5 模塊基因功能富集

將相關性最高的模塊內(nèi)基因上傳至David（https：//david.ncifcrf.gov/）進行在線GO 和KEGG 富集分析，P＜0.05 并且FDR＜0.05 認為是顯著富集。

2 結果

2.1 共表達網(wǎng)絡的構建

圖1 軟閾值β 確定、基因模塊及目的模塊選取

首先通過對GSE41258 研究中47 例結直腸癌肝轉移灶和186例原發(fā)灶的表達譜芯片數(shù)據(jù)進行分析，取方差位于前25%的3137個基因納入了共表達網(wǎng)絡分析，定義無尺度網(wǎng)絡拓撲擬合指數(shù)為0.9，得到最佳軟閾值β=5 時的鄰接矩陣，見圖1-A。基因按照相關性被分成了13 個模塊，經(jīng)模塊間相關性分析后合并后得到12個模塊，見圖1-B。其中與臨床性狀（是否為肝轉移灶）相關性最高（cor=0.59）的為紅色模塊（MEred）（共243 個基因），用于樞紐基因的篩選，見圖1-C。

2.2 樞紐基因的篩選

首先提取紅色模塊中|GS|＞0.2 并且|MM|＞0.8 的基因104 個，見圖2-A。再計算并提取模塊內(nèi)連接度前10%的基因23 個，兩者取交集后得到23 個樞紐基因，見圖2-B。

用23 個樞紐基因構建PPI 網(wǎng)絡，網(wǎng)絡包含18 個節(jié)點，86 條邊。將PPI 網(wǎng)絡導入到Cytoscape 軟件進行可視化，見圖2-C。取得Degree 值排名前十的基因（HRG、GC、SERPINC1、AHSG、F2、CPB2、AMBP、C8A、F9、KNG1）確定為與肝轉移發(fā)生最關鍵的樞紐基因進行下一步研究，見表1。

表1 紅色模塊樞紐基因

2.3 樞紐基因在原發(fā)灶和肝轉移灶中的表達差異

繪制散點圖可見樞紐基因在肝轉移灶的表達量明顯高于原發(fā)灶（P＜0.001），見圖3。使用R 軟件繪制ROC 曲線，ROC曲線分析顯示所有樞紐基因對兩種組織都有很好的鑒別能力（AUC＞0.8），尤其是AHSG、AMBP、GC 的AUC 均大于0.9，見圖4。

圖2 樞紐基因的篩選

圖3 樞紐基因在原發(fā)灶與肝轉移灶中的表達差異，紅色為原發(fā)灶，綠色為轉移灶。（GSE41258，n=233）

圖4 通過ROC 曲線分析樞紐基因對結直腸癌原發(fā)灶和肝轉移的區(qū)分能力

2.4 模塊功能富集分析

為探索紅色模塊中基因參與的潛在生物學過程和功能，我們進行了GO 和KEGG 的功能富集分析。GO 富集結果顯示該模塊基因主要參與凝血系統(tǒng)、免疫調節(jié)和脂肪代謝的生物學過程，KEGG 主要富集在補體、凝血級聯(lián)通路和代謝相關通路，見圖5。

3 討論

結直腸癌肝轉移是腸癌患者死亡的重要危險因素，然而其發(fā)生機制尚未明確。本研究通過WGCNA 的數(shù)據(jù)挖掘方法，篩選與結直腸癌肝轉移臨床性狀最相關的基因模塊，并通過對共表達網(wǎng)絡和PPI 網(wǎng)絡中共有的23 個候選基因進行進一步篩選，確定了10 個與結直腸癌肝轉移密切相關的樞紐基因，并且發(fā)現(xiàn)這些基因參與了補體、凝血和代謝通路的調控。

圖5 模塊基因功能富集

我們研究中共發(fā)現(xiàn)了10 個樞紐基因。其中HRG 是一種75 kDa 的單鏈肝素結合血漿蛋白，由肝臟產(chǎn)生并且mRNA 表達僅限于肝臟，血漿中含量高（100-200 ug/mL）。該糖蛋白具有抗腫瘤和促進腫瘤進展的雙重作用[5]，但是與肝轉移瘤的發(fā)生發(fā)展尚未見報道。GC 即維生素D 結合蛋白，是一種糖基化的a-球蛋白，是維生素D 及其代謝產(chǎn)物的主要轉運體。它參與肌動蛋白和脂肪酸結合、中性粒細胞趨化和巨噬細胞活化[6]。研究發(fā)現(xiàn)維生素D 結合蛋白通過調節(jié)胰島素樣生長因子-1/Akt 通路和維生素D受體轉錄，促進上皮性卵巢癌的進展[7]。但是該基因在癌癥中的作用還存在爭議[6，8-10]，功能有待進一步研究。SERPINC1 也被稱為抗凝血酶III （ATIII），位于染色體1q23-25.1[11]，ATIII 通過抑制凝血因子調節(jié)凝血，對上皮細胞具有抗炎作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)腎癌患者血清和膀胱癌患者腫瘤組織中ATIII 水平的升高，敲除SERPINC1 可以抑制鼻咽癌細胞的生長[13]，同時也是調控結直腸癌肝轉移的關鍵基因[14]。AHSG 是一種陰性的人急性期蛋白，主要由肝臟產(chǎn)生。越來越多的證據(jù)表明，它是一種多功能蛋白質，能夠調節(jié)糖尿病和其他代謝疾病的病因[15]并和促進腫瘤細胞的侵襲[16]。CPB2 基因表達受基因多態(tài)性和白細胞介素10 等細胞因子的影響，與炎性乳癌患者IL10 mRNA 表達、CD14+細胞發(fā)生率及淋巴血管浸潤呈正相關[17]。AMBP 在結直腸癌中尚未見報道，但文獻報道胃癌患者中AMBP 過表達，晚期胃癌患者血清中AMBP 高表達與紫杉醇卡培他濱化療反應差有關[18]。據(jù)報道，C8A 存在于肝癌細胞株HEP3B 的分泌體中，是膜攻擊復合體（MAC）補體系統(tǒng)的末端之一[19]，并且有望成為新的肝癌血液循環(huán)標志物[20]。KNG1 可以利用選擇性剪接產(chǎn)生兩種不同的蛋白質-高分子量激肽原（HMWK）和低分子量激肽原（LMWK）。HMWK對于血液凝固和胰舒血管素系統(tǒng)的組裝至關重要，Makondi 的研究表明其高表達與結直腸癌轉移密切相關，并且發(fā)現(xiàn)miR-576-5p 可以靶向F9 調控結直腸癌的轉移[21]。

對red 模塊的功能富集分析，結果顯示模塊中的基因主要富集在凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)和代謝相關的生物學過程。腫瘤引起炎癥在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。補體系統(tǒng)作為腫瘤促炎的重要組成部分，其激活促進了癌細胞的增殖、去分化和遷移，補體活化調節(jié)適應性免疫反應，可能在調節(jié)T 細胞對腫瘤的反應中發(fā)揮作用[22]。眾所周知，脂肪酸代謝途徑的改善不僅與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，并且與癌癥的遠處轉移息息相關[23,24]。我們的關鍵模塊也富集了補體和凝血級聯(lián)的通路以及相關代謝通路。同時我們注意到樞紐基因在肝轉移灶中明顯高表達，并且AUC 面積都大于0.8，對于臨床診斷有潛在的應用價值。

總而言之，我們研究通過加權共表達網(wǎng)絡識別了10 個結直腸癌肝轉移相關的樞紐基因。這些基因可能通過調控凝血系統(tǒng)、補體系統(tǒng)和代謝相關的生物學過程來影響結直腸癌的肝轉移，并初步探討了其潛在的臨床診斷價值，這些發(fā)現(xiàn)對揭示結直腸癌肝轉移的研究進展具有重要意義。