甲基-CpG結合蛋白1缺失小鼠抑制背根神經節與脊髓背角降鈣素基因相關肽生成緩解炎性疼痛

盛恒煒 磨凱

1南部戰區總醫院麻醉科（廣州510010）；2南方醫科大學珠江醫院麻醉科（廣州510280）

正常感覺信息或傷害性信息傳遞依賴于神經系統感覺傳導通路中痛覺相關基因的完整表達[1-2]。該痛覺相關基因在外周炎癥或神經損傷后的表達改變對急慢性疼痛的誘導和維持至關重要[3]，而且疼痛狀態下的這些疼痛基因的表達依賴于表觀遺傳調控[4-5]。甲基-CpG結合域蛋白1（methyl-CpG-binding domain protein 1，MBD1）是一個具有調節基因轉錄活性的表觀遺傳抑制因子[6-7]。筆者最新研究顯示，MBD1 缺失小鼠能緩解神經損傷引起的疼痛行為，機制上進一步發現背根神經節（dorsal root ganglia，DRG）內MBD1 可募集DNA 甲基化轉移酶DNMT3a 到μ阿片受體基因（Oprm1）和鉀通道蛋白Kv1.2 基因（Kcna2）兩個痛覺相關基因啟動子區抑制其表達，從而調控急性疼痛和神經病理性疼痛的產生和持續[8-9]。因此DRG MBD1 可能是急慢性疼痛的發展和持續的關鍵因素。然而，MBD1 缺失緩解完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA）誘導的慢性炎性疼痛具體機制仍然不清楚[8]，明確這一機制對慢性炎性疼痛病因治療至關重要。

慢性炎性疼痛是由多種炎癥介質刺激C-類纖維產生動作電位并上傳到脊髓背角，其沖動在脊髓內通過背根反射逆行傳到感受外周傷害性刺激的神經末梢，導致神經肽和神經遞質生成和釋放增加，造成血管擴張和滲出增多等炎癥反應，在外周和中樞形成一個正反饋，促進炎性疼痛的發展和持續[10-12]。這些神經肽和神經遞質包括降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、P 物質、神經激肽A和速激肽等，其中CGRP 在介導炎性疼痛發展和持續中發揮重要作用[13-14]。那么，MBD1 缺失是否通過抑制背根神經節和脊髓背角區CGRP的生成與釋放，從而緩解慢性炎性疼痛產生和持續，目前尚未見報道。基于此，本研究擬采用MBD1 敲除小鼠構建小鼠CFA誘導的炎性疼痛模型，檢測DRG和脊髓背角內CGRP 含量改變，探討MBD1 缺失對慢性炎性疼痛調控的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 實驗動物野生型小鼠（wildtype，WT）選用SPF級健康雄性8 周齡C57BL6J 小鼠，體質量約25～30 g 小鼠，由南方醫科大學動物實驗室提供；同時選取年齡、性別和體質量相符的MBD1 敲除小鼠（knockout，KO）與之配對，MBD1 KO 小鼠由美國羅格斯大學新澤西醫學院提供，其遺傳背景與C57BL6J小鼠完全相同，其敲除方法見文獻[8，15]。

1.1.2 分組根據處理方式不同，按隨機數字表法分為4組，分別為做足底注射生理鹽水（normal saline，NS）、CFA的WT小鼠組和注射NS、CFA的KO小鼠組（每組7 只）。小鼠鼠分籠飼養，室溫和濕度分別保持在24±1℃和50%～60%，白天（12 h）一黑夜（12 h）循環照明，實驗前對小鼠進行適應性飼養l 周，本研究依據國際疼痛研究學會（IASP）準則和學校動物倫理委員會許可實施小鼠疼痛實驗。

1.2 MBD1基因敲除小鼠的飼養繁育與基因型鑒定由美國羅格斯大學新澤西醫學院提供的3 只MBD1-/-雄小鼠（純合子）和3 只MBD1+/-雌小鼠（雜合子），該小鼠的遺傳背景為C57BL/6。因雌MBD1-/-純合子小鼠生育力極低，本研究采用一只MBD1-/-純合子雄鼠和一只MBD1+/-雜合子雌鼠同居交配繁育的方式進行繁殖。新生小鼠出生第5～7 d時，無菌條件下將小鼠距離尾端3 mm的鼠尾組織剪斷，標記后置于離心管中。每個離心管中各加入600 μL 50 mmol/L的NaOH 溶液，置于99℃金屬浴中煮20 min。冷卻至室溫后，將每個離心管中各加入100 μL 1M Tris-HCl（pH-7.4），混勻后轉移到離心機中以10 000g離心管5 min。轉移上清100 μL至新的離心管中可存于-20℃冰箱備用。18 μL PCR 反應體系：GoTaq Green Master Mix，2×（Promega 公司，M7122）9.0 μL，上下游引物混合物1 μL，DNA 模板2 μL，dH2O 6.0 μL。反應條件為：第1 步94 °C 1 min 預變性，第2 步94℃變性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40個循環，第3 步72℃5 min，第4 步冷卻到20℃后反應結束。取10 μL PCR 產物加入含6 μL 溴化乙啶的100 mL 電泳緩沖液制備的2%瓊脂糖膠板上樣孔內，電泳槽中電泳（135 V）20 min，然后置入凝膠成像儀中進行成像保存并觀察電泳條帶，依照特定的基因條帶對各個小鼠的基因型進行鑒定（圖1）。基因型鑒定引物序列：WT 正義鏈5′-TCTTCTCAGACTGAGGAAGGGTGA-3′，反義鏈：5′-CAAGGTCCAACGCCACTGAACAT-3′，350 bp；KO 正義鏈：5′-GGATTCTCCGTGGGAACAAACG-3′，反義鏈：5′-CAAGGTCCAACGCCACTGAACAT-3′，450 bp。

圖1 基因型鑒定典型圖Fig.1 Genotype identification

1.3 CFA慢性炎性痛模型制備按50%乳化的弗氏完全佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA，美國Sigma 公司）10 μL 皮下注射到小鼠左足底（等量的生理鹽水做對照）建立CFA 炎性疼痛模型，4組小鼠分別于注射前1 天（-1 d）、注射后2 h、1、3、7和14 d 測定機械痛閾和輻射熱痛閾，具體方法如下。

1.4 小鼠疼痛行為學測定

1.4.1 機械痛閾測定CFA注射前（-1 d）、注射后2 h、1、3、7和14 d時，各組小鼠放置于有機玻璃箱內適應30 min 安靜后，使用0.4 g von Frey 細絲測定各組小鼠后肢機械痛閾。方法同既往文獻，即將纖毛絲垂直刺激各小鼠后足底中部，當小鼠受刺激出現縮足、抬腿，記做1次陽性反應，連續刺激10次，每次間隔5 s，記錄10次刺激中出現陽性反應的頻數，完成各組測試后計算縮爪反應頻率（paw withdrawal frequency，PWF）=（有效反應次數/10）×100%，以此評定小鼠機械痛閾。

1.4.2 輻射熱痛閾測定CFA注射前（-1 d）、注射后2 h、1、3、7和14 d時，各組小鼠放置于恒溫的玻璃臺上的有機玻璃籠內，維持小鼠足底皮膚的溫度恒定，室溫穩定在22～24℃，30 min 適應環境后，采用熱輻射刺激儀（美國life science instruments 公司）照射小鼠的后足底中部，記錄從照射開始到小鼠出現抬足的時間，記為熱縮足反應潛伏期（paw withdrawal latency，PWL），來判定小鼠熱痛敏情況。輻射適宜強度調整為8～12 s，設置刺激切斷時間為20 s 以免熱輻射灼傷小鼠皮膚，每次刺激間隔15 min，連續刺激5次，記錄5次測量的平均值作為該后爪PWL 值。

1.5 ELISA法測 定DRG和脊髓 背角CGRP 含量 另取上述4組小鼠（每組3 只）于CFA注射后1天（CFA 致痛最明顯時點）機械痛閾和熱痛閾測定結束后，七氟醚深度麻醉后處死，快速取出患側和對側L3和L4 DRG組織和腰膨大處脊髓患側和對側背段。按CGRP EIA 試劑盒（法國SPI-BIO 公司）操作說明，取出4組患側脊髓背角組織（左側）冰上化解后稱重，按5 mL：1 g組織加入2N 乙酸（即：5.88 mL 乙酸加44.12 mL 配置成50 mL 溶液）充分勻漿，90℃加熱10 min，1 500g離心10 min，轉移上清至新管，負壓離心空干上清后獲得沉于管底的固態顆粒，等乙酸體積的EIA 緩沖液重懸溶解，根據我們既往經驗，重懸液按1∶50 稀釋成200 μL備用。檢測前每孔加入300 μL 漂洗液，倒扣空干，反復漂洗5次封閉非特異性抗原表位。每排第1 孔做空白孔（Blank），第2 孔加100 μL EIA 緩沖液陰性對照，第3和4 孔依次滴加8個標準樣品（100 μL），2個重復測定標準曲線，其余4 孔滴加稀釋好的100 μL上述4組樣品，每個樣品3個重復；隨后每孔加入100 μL anti-CGRP AchE 標記物，塑封后4℃孵育16 h。孵育結束，倒置空干，300 μL漂洗液震蕩2 min 漂洗3次后，每孔加入200 μL Ellman′s 顯色試劑，鋁箔紙避光，震蕩45 min，設置波長為405 nm的自動化酶標儀（美國Bio-Tek 公司）讀取吸光度。數據分析：各組吸光度值減去空白孔均值，根據8 點標準曲線計算各樣品CGRP 濃度，將所有組校正到WT-NS組，以倍數表達比較組間差異。

1.6 統計學方法數據分析采用SigmaPlot 12.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，多重比較采用單因素方差分析，組內比較采用Tukey 法檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠患側PWF的比較CFA注射后2 h、1、3、7和14 d，4組小鼠患側PWF 比較差異有統計學意義（F= 268.093，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠組比較，注射CFA的WT 小鼠患側PWF 增加，差異有統計學意義（P＜0.05），而與注射CFA的KO 小鼠患側相比，差異無統計學意義（P＞0.05，圖2）。表明MBD1 缺失顯著緩解CFA誘導的機械痛覺過敏。

圖2 4組小鼠患側PWF的比較（n=7）Fig.2 Comparation of hind paw withdrawal frequency of ipsilateral sides in vehicle and CFA treated wildtype or Mbd1-/-mice at before 1 day，2 hours，1 day，3 days，7 days and 14 days after CFA injection（n=7）

2.2 4組小鼠對側PWF的比較CFA注射前（-1 d）以及注射后2 h、1、3、7和14 d，4組小鼠對側PWF 比較差異有統計學意義（F= 191.525，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠對側后爪比較，注射CFA的WT 小鼠對側后爪PWF 無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05），而與注射生理鹽水和CFA的KO 小鼠對側后爪相比，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3）。表明MBD1 缺失可提高小鼠對機械刺激的基礎痛閾。

圖3 4組小鼠對側PWF的比較（n=7）Fig.3 Comparation of hind paw withdrawal frequency of contralateral sides in vehicle and CFA treated wildtype or Mbd1-/-mice at before 1 day，2 hours，1 day，3 days，7 days and 14 days after CFA injection（n=7）

2.3 4組小鼠患側PWL的比較CFA注射后2 h、1、3、7和14 d，4組小鼠患側PWL 比較差異有統計學意義（F= 797.954，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠組比較，WT 小鼠在CFA注射后2 h、1、3、7和14 d的PWL 明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而與注射CFA的KO 小鼠患側相比，僅在CFA注射后1 d 有差異（P＜0.05），其余差異無統計學意義（P＞0.05，圖4），表明MBD1 缺失可緩解CFA注射側后爪引起的熱痛覺過敏。

圖4 4組小鼠患側PWL的比較（n=7）Fig.4 Comparation of hind paw withdrawal latency of ipsilateral sides in vehicle and CFA treated wildtype or Mbd1-/-mice at before 1 day，2 hours，1 day，3 days，7 days and 14 days after CFA injection（n=7）

2.4 4組小鼠對側PWL的比較在CFA注射前（-1 d）以及注射后2 h、1、3、7和14 d的時間點，4組小鼠對側PWF 比較差異有統計學意義（F=290.491，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠對側后爪比較，注射CFA的WT 小鼠對側后爪PWF 無明顯差異（P＞0.05），而與注射生理鹽水和CFA的KO 小鼠對側后爪相比，差異有統計學意義（P＜0.05，圖5）。表明MBD1 缺失小鼠可更好的耐受熱傷害性刺激。

圖5 4組小鼠對側PWF的比較（n=7）Fig.5 Comparation of hind paw withdrawal latency of contralateral sides in vehicle and CFA treated wildtype or Mbd1-/-mice at before 1 day，2 hours，1 day，3 days，7 days and 14 days after CFA injection（n=7）

2.5 4組小鼠患側DRG內CGRP 含量的比較CFA注射后1 d，4組小鼠患側L3/4 DRG 內CGRP含量比較差異有統計學意義（F= 64.384，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠組比較，WT小鼠DRG 內CGRP 顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），注射生理鹽水的KO 小鼠DRG 內CGRP 顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而注射CFA的KO 小鼠DRG 內CGRP 無明顯變 化（P＞0.05，圖6），表明MBD1 缺失可抑制CFA 引起的DRG 內CGRP 含量增加。

2.6 4組小鼠患側脊髓背角內CGRP含量的比較 CFA注射后1 d，4組小鼠患側腰膨大處脊髓背角內CGRP 含量變化差異有統計學意義（F=19.019，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠組比較，WT 小鼠脊髓背角內CGRP 含量顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），注射生理鹽水的KO 小鼠脊髓背角內CGRP 顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而注射CFA的KO 小鼠脊髓背角內CGRP 無明顯變化（P＞0.05，圖7），表明MBD1 缺失可抑制CFA 引起的脊髓背角內CGRP含量增加。

圖6 4組小鼠患側DRG 內CGRP 含量的比較（n=3）Fig.6 Comparation of CGRP content of L3/4 ipsilateral sides of dorsal root ganglia in four group mice at 1 day after CFA injection（n=3）

圖7 4組小鼠患側脊髓背角內CGRP 含量的比較（n=3）Fig.7 Comparation of CGRP content of L3/4 ipsilateral sides of spinal dorsal horn in four group mice at 1 day after CFA injection（n=3）

3 討論

傷害性疼痛是維持機體完整所必需的重要組成部分，是抵御外界侵擾和適應環境重要神經活動[16]。在有/無外界傷害性刺激下，炎癥性疼痛即可引起機械和熱刺激痛覺過敏，部分原因是炎癥引起炎癥介質釋放導致神經傳導通路中的DRG和脊髓背角區神經肽CGRP 生成和釋放增加導致中樞敏化[17-18]。本研究結果顯示，MBD1 缺失小鼠緩解CFA 誘導的炎性疼痛引起機械和熱刺激痛覺過敏，可能是通過抑制DRG和脊髓背角區神經肽CGRP 生成和釋放來實現，表明MBD1是調控慢性炎性疼痛重要的關鍵因子。

慢性疼痛的形成被認為是由炎癥、組織損傷和/或神經損傷引起DRG、脊髓背角和疼痛相關的腦區感覺神經元基因表達的變化引起[19]。CGRP作為疼痛因子參與炎性、軀體性、內臟性和神經性等多種慢性疼痛的過程，其表達亦受包括表觀遺傳機制在內的多種因子調控[20-21]。越來越多的研究表明，CGRP 在外周神經元、脊髓背角上調，促進傷害性信號傳播，介導外周敏化加劇炎癥和神經性疼痛中起著關鍵作用[22-23]。抑制其表達對緩解慢性疼痛的產生和維持至關重要。表觀遺傳修飾是控制基因表達的重要方式，參與了慢性疼痛的發生和持續過程[24]。DNA 甲基化作為表觀遺傳修飾控制基因表達的重要方式之一，可通過多種機制抑制基因轉錄，包括甲基-CpG結合域蛋白（MBD）家族作為轉錄抑制因子或共抑制因子結合到啟動子區CpG 島抑制轉錄活動[6，25]。本研究發現，對甲基化結合域蛋白MBD1 進行小鼠敲除，可以有效緩解小鼠CFA注射后14 d 內的炎性疼痛行為。進一步通過選取疼痛最明顯的時點（CFA注射后1 d）取材檢測，進一步發現MBD1 敲除可降低DRG和脊髓背角區域神經肽CGRP 總水平，進而抑制CFA 炎性誘導引起的CGRP 生成和釋放增加。另外，本課題組發現DRG 神經元細胞核內的MBD1 蛋白與CGRP 標記物共表達于同一個DRG小神經元內[8]。上述研究結果表明，MBD1 敲除緩解慢性炎性疼痛可能是通過下調DRG和脊髓背角神經肽CGRP的生成與釋放來實現。然而，本研究仍然不清楚MBD1 敲除具體影響到哪種神經細胞CGRP的分泌和釋放，筆者將在以后的實驗中使用離體原代細胞去進一步驗證。

綜上所述，小鼠DRG和脊髓背角區域內神經肽CGRP 表達上調參與了CFA 誘導的慢性炎性疼痛形成；MBD1 敲除可緩解CFA 誘導的機械和熱刺激痛覺過敏，機制可能與抑制DRG和脊髓背角內CGRP 生成和釋放有關。