姬松茸多糖對D-半乳糖誘導的衰老模型小鼠的抗衰老作用及其Keap1/Nrf2/ARE信號轉導途徑機制

段懿涵，盛 瑜，徐 健，盧學春，杜培革，安麗萍

(北華大學藥學院藥物分析教研室，吉林 吉林 132013)

衰老作為一種不可避免的生理過程，可導致身體部分功能逐漸喪失，其中認知能力下降已成為老年人最大的健康威脅之一[1]。近年來有許多關于衰老相關機制的研究，如衰老的端粒學說、自由基學說和代謝失衡學說等[2-4]。其中，自由基學說表明當人體內自由基生成過多或對其清除能力降低時，將發生各種嚴重病變[5]，因此清除過量活性氧自由基具有重要的生理意義，安全有效的天然抗衰老藥物成為人們關注焦點。

姬松茸(Agaricus blazei Murill,ABM) 又名巴西蘑菇，是食藥兼用的名貴真菌[6]。姬松茸子實體主要成分包括蛋白質、多糖、脂肪、纖維和維生素等，其中多糖含量可達45%。多糖不僅是維持生命活動的功能性大分子，同時有廣泛的藥理學作用，如降血脂、降血糖、抗血栓、 保肝和通過增加白細胞含量減少放射性破壞的生物活性[7]。研究[8]表明：姬松茸多糖(Agaricus blazei polysaccharide,ABP)具有抗腫瘤、調節免疫、改善脂質水平和保護損傷神經等作用。目前，關于ABP抗衰老功效少有報道。本課題組前期研究[9]證實：ABP具有明顯的抗氧化活性，體外清除自由基作用顯著，由此本文作者推測ABP可能具有抗衰老的作用。

本研究分離純化獲得姬松茸酸性多糖A級分(Agaricus blazei polysaccharide-A，ABP-A)，利用 D-半乳糖(D-galactose,D-Gal)誘導建立小鼠衰老模型，觀察ABP-A的抗衰老作用，探討其抗衰老作用的分子機制，旨在為研發天然的抗衰老藥物提供新資源和研究基礎，為進一步開發和利用ABM提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器選取48只雄性ICR小鼠，體質量200～220 g，由長春億斯實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(吉) 2016-0003，本實驗通過本校實驗動物倫理委員會審查(倫理號IACUC-2018-004)，實驗過程遵循3R原則給予人道關懷。ABM(沈陽聚鑫北蟲草菌業有限公司，由北華大學藥學院藥用植物學教研室韓冬老師鑒定合格)，D-Gal(美國Genview公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)測試盒(南京建成生物研究所)，一抗β-actin、Nrf2、Keap1、HO-1和二抗HRP-Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美國ABclona公司)。Infinite M200型酶標儀(瑞士TECAN公司)，SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(上海蘇凈實業有限公司)，TM-100 Morris水迷宮BA-200、小鼠避暗儀DT-200和小鼠跳臺測試箱(成都泰盟技術有限責任公司)，BA 400顯微鏡(麥克奧迪實業集團公司)，離心機(德國Eppendorf公司)，超微量核酸蛋白測定儀(德國Scandrop公司 )。

1.2 ABP-A的制備取干燥至恒重的ABM，按水料比20∶1(V/W)，100℃提取3次，每次3 h，提取液濃縮離心， 80%乙醇醇沉上清液，靜置過夜，離心收集沉淀，依次用95%乙醇、無水乙醇洗滌，常規干燥得水提姬松茸粗多糖，透析，冷凍干燥，得ABP；利用DEAE-纖維素柱(7.5×30 cm，Cl-型)進行分級，0.5 mol·L-1NaCl洗脫，除鹽，冷凍干燥，得到ABP-A。

1.3 實驗動物分組和給藥48只ICR小鼠隨機分為4組，模型組小鼠頸背部皮下注射400 mg·kg-1·d-1D-Gal；對照組小鼠注射同劑量生理鹽水；陽性藥組小鼠先皮下注射400 mg·kg-1·d-1D-Gal，然后灌胃 800 mg·kg-1吡拉西坦(按照人每日口服劑量為40～80 mg·kg-1)； ABP-A組小鼠先皮下注射400 mg·kg-1·d-1D-Gal，然后灌胃400 mg·kg-1ABP-A(按照人每日口服最大劑量計算)。連續給藥10周。

1.4 行為學實驗給藥第9 周進行避暗實驗，將小鼠面部背對洞口放入明室中，進行訓練和重實驗，記錄5 min內小鼠進入暗室的次數和首次進入暗室的時間，即錯誤次數和潛伏期，間隔24 h后開始實驗。

跳臺實驗：小鼠遭電擊后逃到安全臺上，再次下臺遭受電擊時視為錯誤反應，記錄 3 min內的潛伏期和錯誤次數[10]，24 h后再次測驗。

Morris水迷宮定位航行實驗：設定實驗時間為120 s，小鼠從入水到找到安全平臺所需的時間即為逃避潛伏期。若120 s內找到平臺，則使其在平臺上停留10 s；若120 s內未找到平臺，則將其引導至平臺，并停留10 s，潛伏期記錄為120 s。第7天開始空間搜索，撤掉平臺，將小鼠從第Ⅱ象限入水，持續時間120 s。記錄小鼠進入平臺、目標區域及目標象限的次數。

1.5 各組小鼠血清生化指標檢測小鼠行為學實驗結束后，將小鼠眼球取血，離心，取血清備用。處死的小鼠，迅速于冰臺上取出全腦。嚴格按照各試劑盒說明書進行操作，對小鼠血清進行檢測。采用酶聯反應法分析ROS水平，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，比色法檢測T-AOC活性，采用比色法檢測CAT活性及硫代巴比妥酸法測定MDA水平。

1.6 Western blotting法檢測各組小鼠腦組織中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達水平提取小鼠腦組織海馬區蛋白，以12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜2 h至甲醇處理后的聚丙二氟乙烯膜(PVDF)上，轉膜，置于搖床，用含5%脫脂奶粉的TBS-T封閉液封閉1 h，然后加入一抗β-actin(1∶50 000)、Nrf2(1∶500)、Keap1(1∶500)和HO-1(1∶500)室溫孵育2 h，采用TBS-T洗5次，每次15 min，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBS-T洗5次，每次15 min，最后加入ECL顯色液顯色。將顯影得到的條帶進行灰度分析，以β-actin為內參，以Keap1、Nrf2和HO-1各條帶與內參條帶灰度值的比值表示蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 ABP-A的制備透析袋透析除去灰分，得ABP，利用 DEAE-纖維素柱進行離子交換層析，0.5 mol·L-1NaCl 溶液洗脫得到ABP-A。ABP得率為4.7%、總糖含量為75.1%、糖醛酸含量為1.9%、蛋白含量為5.6%；ABP-A得率為 47.5%、總糖含量為 74.1%、糖醛酸含量為8.2%。見表1。

表1 ABP和ABP-A的成分分析

Tab.1 Composition analysis of ABP and ABP-A(η/%)

PolysaccharideYieldTotal sugarUronic acidproteinAshABP4.775.11.95.65.1ABP-A47.574.18.24.85.1

2.2 各組小鼠行為學實驗觀察指標避暗實驗結果顯示：與對照組比較，模型組小鼠避暗潛伏期明顯縮短(P<0.05或P<0.01)，錯誤次數明顯增多(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組和ABP-A 組小鼠避暗潛伏期延長(P<0.05或P<0.01)，錯誤次數減少(P<0.05)。跳臺實驗結果顯示：與對照組比較，模型組小鼠跳臺潛伏期明顯縮短(P<0.05)，錯誤次數明顯增多(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組和ABP-A 組小鼠跳臺潛伏期延長(P<0.05或P<0.01)，錯誤次數減少(P<0.05)。見表2。

表2 避暗和跳臺實驗中各組小鼠潛伏期和錯誤次數

Group Dark avoidance latency(t/s)TrainingRetentionNumber of dark avoidance errorsTrainingRetentionControl24.54±2.5090.60±2.845.56±0.513.94±0.84Model18.49±1.61?34.29±3.91??8.94±0.25?7.82±0.71?Positive drug 20.91±3.5985.89±3.94△△6.82±0.32△4.65±0.44△ABP-A14.88±2.5395.84±3.96△△6.06±0.34△4.50±0.66△GroupStep down latency(t/s) TrainingRetention Number of platform errorsTrainingRetentionControl29.39±2.5099.58±2.842.86±0.221.00±0.20Model13.09±3.61?76.49±4.91?3.33±0.31?1.93±0.26?Positive drug 35.63±3.59△86.10±3.94△2.13±0.19△1.40±0.27△ABP-A32.03±2.53△88.03±5.96△△2.06±0.34△1.31±0.21△

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

Morris水迷宮實驗結果顯示：定位航行實驗中，隨著訓練時間的延長，各組小鼠定位航行潛伏期呈下降趨勢(P<0.05)。對照組小鼠定位航行潛伏期下降幅度最大，模型組下降幅度最小。第2～6天，與對照組比較，模型組小鼠定位航行潛伏期明顯延長(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥物組和ABP-A 組小鼠定位航行潛伏期從第2天開始明顯縮短(P<0.05)。見圖1?？臻g搜索實驗中，與模型組比較，陽性藥物組和ABP-A組小鼠進入平臺的時間(潛伏期)明顯縮短(P<0.05)。進入平臺的次數明顯增加(P<0.05)。見圖2(插頁五)和圖3。

圖1 Morris水迷宮實驗中各組小鼠定位航行潛伏期

Fig.1 Latencies of positioning and navigation of mice in various groups in Morris water maze test

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.

圖3 Morris水迷宮實驗中各組小鼠空間探索指標

Fig.3 Space exploration indicators of mice in various groups in Morris water maze test

2.3 各組小鼠血清生化指標與對照組比較，模型組小鼠血清中SOD和CAT活性及T-AOC明顯降低(P<0.05)， ROS水平升高(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥物組和ABP-A組小鼠血清中SOD活性和T-AOC升高(P<0.05)， CAT活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)，ROS水平降低(P<0.05)，MDA水平明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.4 各組小鼠腦組織中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達水平與對照組比較，模型組小鼠腦組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，Keap1蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥物組和ABP-A組小鼠腦組織中Keap1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，Nrf2和HO-1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見圖4和圖5。

表2 各組小鼠血清生化指標

GroupSOD[λB/(U·mL-1)]CAT[λB/(U·mg-1)]T-AOC[cB/(mmol·L-1)]ROS[λB/(U·mL-1)]MDA[cB/(nmol·L-1)]Control60.97±3.612.47±0.490.67±0.0860.77±5.651.69±0.52Model46.55±5.52?2.06±0.37?0.56±0.04?84.67±7.59?4.82±0.24??Positive drug 62.08±2.76△2.57±0.11△0.70±0.06△△75.29±9.45△1.33±0.34△△ABP-A60.93±3.64△3.73±0.48△△0.65±0.04△70.93±9.90△1.57±0.29△△

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

Lane 1: Control group; Lane 2:Model group; Lane 3:Positive drug group; Lane 4:ABP-A group.

圖4 Western blotting法檢測各組小鼠腦組織中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of Nrf2,Keap1 and HO-1 proteins in brain tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

圖5 各組小鼠腦組織中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表達水平

Fig.5 Expression levels of Nrf2,Keap1 and HO-1 proteins in brain tissue of mice in various groups

3 討 論

衰老是生命發展的最后一個階段，是隨著時間的推移，機體的各種功能不斷下降的過程,衰老的發生與氧化應激的積累密切相關[11]。D-Gal作為生理性營養成分，過量時會誘發機體氧化損傷、炎癥以及細胞凋亡等,與自然衰老癥狀相似[12-13]。本研究中連續給予過量D-Gal后，模型組小鼠活動減少，毛發脫落，行為學實驗表現出潛伏期較短，錯誤次數增多現象，說明小鼠衰老模型建立成功。SOD和CAT等組成的酶系統具有內源性抗氧化損傷作用，通過代謝轉化可去除過量ROS減輕氧化應激[14]。T-AOC通常被認為是體內所有抗氧化劑的累積作用，具有評估抗氧化能力的作用[15]。MDA是氧自由基和脂質氧化的降解產物，其水平的升高導致自由基的產生增多和(或)抗氧化物質功能下降[16]。本研究結果顯示：給予 ABP-A 干預后，小鼠血清中SOD和 CAT活性升高，T-AOC升高，MDA和ROS水平降低，小鼠一般狀態得到有效改善，學習記憶能力提高，說明ABP-A能減緩由D-Gal 誘導的機體氧化損傷程度，進而對衰老引起的學習記憶衰退具有良好的修復作用。

Keap1/Nrf2/ARE信號通路的激活可誘導產生一系列內源性酶，如SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧還原酶等，這些自由基清除酶能夠參與機體的抗氧化防御機制[17]。此外，Keap1/Nrf2/ARE作為氧化應激中重要的信號通路之一，是防御外源物質和細胞氧化損傷，減少氧化應激和介導抗氧化的主要途徑[18-19]，其中，Keap1蛋白含有半胱氨酸殘基，這些殘基在維持細胞氧化還原平衡方面起著至關重要的作用；轉錄因子Nrf2是抵御細胞環境壓力的核心，在氧化應激中具有中心地位。在正常情況下，Keap1與Nrf2結合錨定在細胞質內，使Nrf2處于非活性狀態。而在氧化應激下，Nrf2與其負調控因子Keapl脫離，并從細胞質轉移至細胞核中[20]。 Nrf2在細胞核內調節與DNA上的抗氧化反應元件ARE結合，上調可以催化體內多種抗氧化途徑的下游基因HO-1的轉錄和表達[21],清除體內過量ROS抵抗氧化應激, 從而起到細胞保護作用。本研究結果顯示：ABP-A干預后，模型小鼠腦組織中Keap1表達水平下調，且Nrf2和HO-1表達水平上調，表明ABP-A抗衰老作用與激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路有關聯。

綜上所述， ABP-A可以改善 D-Gal 誘導的衰老過程中的小鼠腦損傷，提高機體內的抗氧化酶活性，并降低脂質過氧化，具有明顯的抗衰老作用，其抗衰活性可能與激活Keap1/Nrf2/ARE信號轉導途徑有關。本研究為ABM作為保健品和藥品原料的研究提供了理論依據，對促進ABM的產業化深度開發具有重要意義。