囊胚玻璃化冷凍保存時長對復蘇移植臨床結局的影響

肖亞玲，王雪，孫正怡，甄璟然，郁琦，鄧成艷，周遠征，王含必

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦科內分泌與生殖中心，北京 100730)

隨著近幾年我國二胎政策的放開，越來越多通過體外受精技術生育過一胎的夫婦再次到生殖中心就診，希望復蘇前次冷凍的胚胎進行移植，于是出現了大量復蘇長期凍存胚胎的情況。由于胚胎冷凍保存的時間長短不一，其復蘇后的發育潛能和隨后的妊娠結局是否受到冷凍時長的影響這一問題也引起了越來越多患者和醫務人員的關注。冷凍胚胎保存時限的中國專家共識中提出胚胎冷凍保存6年內不影響胚胎復蘇后存活率、著床率、妊娠率、活產率以及子代出生缺陷率，但是尚無足夠證據證實胚胎冷凍保存時間超過6年對凍融胚胎移植安全性有影響[1]。目前國內外冷凍保存6年以上復蘇移植的大樣本的研究很少，出現的也多為小樣本或個例報道。本研究將探討使用開放系統囊胚玻璃化冷凍保存時長對復蘇移植妊娠結局和新生兒結局的影響，進一步探討超過6年的玻璃化冷凍保存是否對胚胎的臨床結局有影響，從而對今后的臨床工作進行指導。

資料和方法

一、研究對象

選取2006年3月至2018年12月期間在北京協和醫院婦科內分泌與生殖中心進行玻璃化冷凍復蘇囊胚移植的患者，排除各種子宮異常(包括子宮肌瘤、子宮肌腺癥、子宮內膜病變及畸形子宮患者)、惡性腫瘤以及取卵年齡40歲以上的患者。最后納入研究2 643例。根據囊胚冷凍保存時長將其患者資料分為7組：≤1年，1～2年，2～3年，3～4年，4～5年，5～6年和≥6年。

二、研究方法

1.促排卵及囊胚培養：所有患者采用激動劑降調方案或拮抗劑方案促排卵，通過陰道B超引導下進行穿刺取卵，根據患者情況進行IVF或ICSI授精操作。取卵24 h后判斷受精情況，第3天評估卵裂期質量并移植，剩余全部胚胎均經患者知情同意后進行囊胚培養，第5天和第6天分別觀察囊胚形成情況，采用Gardner評分法進行囊胚評分[2]，并將囊胚擴張到4期、內細胞團級別為B級及以上的囊胚進行玻璃化冷凍保存。其中內細胞團和滋養層細胞級別均在B級及以上級別的為優質胚胎。所有胚胎在37℃、5% O2、6%CO2的條件下培養。

2.玻璃化冷凍：冷凍之前使用激光對囊胚進行人工皺縮，待胚胎皺縮良好再進行冷凍。冷凍液分為3個濃度梯度，1號冷凍液為基礎培養液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)，胚胎在此液體中平衡1～2 min。2號冷凍液為含有7.5%(v/v)二甲基亞砜和7.5%(v/v)乙二醇的基礎培養液，胚胎在此液體中平衡2 min，并多次輕柔吹吸。3號冷凍液為基礎培養液內添加了15%(v/v)二甲基亞砜+15%(v/v)乙二醇+0.65 mol/L蔗糖+10 mg/ml聚蔗糖Ficoll，將胚胎在此液體中反復吹吸混勻至少20次，之后轉移到冷凍載桿并投入液氮，3號液體操作時間為25～30 s。所有操作均在37℃工作臺上進行。

3.囊胚復蘇：囊胚復蘇于移植當天進行。復蘇液也分為3個濃度梯度，在基礎培養液內，1號復蘇液添加0.33 mol/L的蔗糖，胚胎在此液體中停留2 min。2號復蘇液為有0.2 mol/L的蔗糖溶液，胚胎在此液體中停留3 min。3號復蘇液為基礎培養液，胚胎在此液體中停留5 min并用激光在遠離細胞團的透明帶上切割約1/4進行輔助孵化，之后轉移至囊胚培養液中放入三氣培養箱中培養2 h后移植。復蘇操作均在37℃工作臺上進行。

4.內膜準備及胚胎移植：患者內膜準備如之前文獻所述[3]，分為兩種方法。第一種為自然周期，在B超監測排卵前注射HCG(艾澤，默克雪蘭諾，德國)，監測到卵泡破裂后第6天進行復蘇移植，根據激素測定值必要時肌肉注射HCG。第二種方法為人工周期法，在月經第2～4天常規B超檢查，口服戊酸雌二醇(補佳樂，先靈，德國)，當內膜厚度≥8 mm時肌肉注射黃體酮(20 mg/支，浙江仙琚制藥)轉化內膜，肌肉注射黃體酮后第6天進行復蘇移植，移植后肌肉注射黃體酮進行黃體支持。

三、觀察指標及判定標準

比較各組患者一般情況(取卵年齡、移植年齡、平均移植胚胎數、囊胚冷凍前優質胚胎率和冷凍時D5胚胎比例)，臨床結局(復蘇存活率、種植率、妊娠率、流產率、異位妊娠率、活產率)，活產出生結局(單胎率、出生男孩率、出生缺陷發生率)和單胎新生兒出生結局(出生體重、身長、孕天數)之間的差異；使用二分類Logistic回歸分析對相關參數對臨床妊娠率和活產率的影響進行分析。

種植率：B超下見到妊娠囊總數占移植胚胎總數的百分比；妊娠率：移植4周后B超下見到妊娠囊總例數與移植周期總例數的百分比；活產率：隨訪獲得活產的總例數與移植周期總例數的百分比；流產率：在臨床妊娠過程中流產的例數占臨床妊娠總例數的百分比；異位妊娠率：發生異位妊娠的總例數占臨床妊娠總例數的百分比；單胎率：單胎出生的總例數占活產例數的百分比；出生缺陷發生率：出生缺陷發生的總例數占活產例數的百分比。

四、統計學分析

使用spss21.0軟件進行統計學分析。連續變量采用均值±標準差表示，用單因素方差分析進行組間比較；分類變量用率(%)來表示，用卡方檢驗(χ2)或Fisher精確檢驗進行組間比較。并采用二分類Logistic回歸分析，以取卵年齡、移植年齡、胚胎冷凍保存時間、胚胎級別和囊胚發育速度為自變量，妊娠率和活產率為因變量，對妊娠率和活產率的影響進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、患者總體情況

本研究一共收集了2 650例囊胚冷凍復蘇周期資料，其中7例因復蘇后胚胎質量差或內膜等問題取消移植，復蘇后取消率為0.26%，最終移植2 643例，胚胎冷凍保存時間最長為11.77年。

取卵年齡20.36～40.00歲，平均年齡(32.35±3.90)歲，移植年齡21.04～45.08歲，平均年齡(33.43±3.96)歲。復蘇胚胎總數為4 739枚，其中復蘇后存活4 689枚，復蘇存活率為98.94%。移植胚胎總數為4 675枚，種植率為42.78%(2 000/4 675)，妊娠率為56.11%(1 483/2 643)，流產率為13.69%(203/1 483)，異位妊娠率為1.08%(16/1 483)，活產率為47.22%(1 248/2 643)，出生缺陷發生率為0.72%(9/1 248)。

二、患者一般情況比較

各組周期數、取卵年齡、移植年齡、平均移植胚胎數、移植優質胚胎率和移植D5胚胎率表1所示。單因素方差分析結果顯示取卵年齡、移植年齡和優質胚胎比例各組之間差異有統計學意義(P<0.05)，≥6年組的取卵年齡顯著小于其他組，而移植年齡顯著大于其他組，優質胚胎率也高于其他組。各組平均移植胚胎數和D5胚胎比例無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者一般情況比較[(-±s)，%]

三、冷凍復蘇移植臨床結局比較

各組臨床結局結果補充：≤1年組有3例妊娠結局失訪，1～2年組1例妊娠結局失訪，1例死產，3～4年組有3例妊娠結局失訪，4～5年組有3例妊娠結局失訪，5～6年組有3例妊娠結局失訪，失訪率為0.49%。卡方檢驗結果顯示復蘇胚胎存活率、妊娠率和活產率各組之間差異有統計學意義(P<0.05)，其中1～2年組的存活率、妊娠率和活產率均最低，分別為97.19%、48.87%和39.27%，而≥6年組的復蘇胚胎存活率、妊娠率和活產率均高于總的存活率、妊娠率和活產率。各組種植率、流產率、異位妊娠率無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組冷凍復蘇移植臨床結局比較(%)

經過Logistic回歸對影響妊娠率的因素進行分析，結果顯示取卵年齡、移植年齡和冷凍保存的時長對妊娠率沒有顯著影響(P>0.05)。而移植D5胚胎比例和優質胚胎的個數對妊娠率有影響，移植全部不為D5(移植全為D6)胚胎相對于移植全部為D5胚胎的妊娠率降低[OR=0.606，95%CI(0.511，0.720)，P=0.000]；移植1個優質胚胎(包括只移植1個優質胚胎、移植1個優質胚胎和1個非優質胚胎、移植1個優質胚胎和2個非優質胚胎三種情況)和2個優質胚胎(包括只移植2個優質胚胎、移植2個優質胚胎和1個非優質胚胎兩種情況)相對于移植0個優質胚胎妊娠率增加(P=0.000)(表3)。

表3 影響妊娠率因素的Logistic回歸分析結果

經過Logistic回歸對影響活產率的因素進行分析，結果顯示取卵年齡和冷凍保存時長對活產率沒有顯著影響(P>0.05)。而移植年齡對活產率有影響，移植年齡的增加會降低活產率[OR=0.976，95%CI(0.956，0.996)，P<0.05]。同樣的移植D5胚胎比例和優質胚胎的個數對活產率有影響，移植全部不為D5(移植全為D6)胚胎相對于移植全部為D5胚胎的活產率降低(P=0.000)，移植1個優質胚胎和2個優質胚胎相對于移植0個優質胚胎活產率增加(P=0.000)(表4)。

四、活產情況比較

各組活產情況比較結果：≥6年組活產24例，單胎率[75%(18/24)]高于其他組，出生男孩比例[60%(18/30)]高于其他組，出生缺陷發生率為0，低于或等于其他組。經卡方檢驗，各組活產的單胎率、出生男孩比例和出生缺陷發生率均無統計學差異(P>0.05)(表5)。

五、單胎新生兒出生結局比較

各組單胎新生兒出生結局：≥6年組單胎18例，單胎出生體重(3 348.33±480.89)g，單胎身長(50.00±1.91)cm，孕天數為(267.72±13.84)d；經單因素方差分析，各組的單胎出生體重，單胎身長和孕天數無統計學差異(P>0.05)(表6)。

表4 影響活產率因素的Logistic回歸結果

表5 各組冷凍復蘇移植活產情況比較(%)

表6 各組冷凍復蘇移植單胎新生兒出生結局比較(-±s)

討 論

胚胎冷凍保存技術是輔助生殖技術最重要的衍生技術。大部分IVF周期在新鮮移植后都會剩余胚胎，有的患者因子宮或其他疾病不能進行新鮮周期移植，此時便需要將胚胎冷凍保存或者將胚胎培養至囊胚階段并冷凍保存。胚胎冷凍保存有利于提高單個取卵周期的胚胎利用率和累積妊娠率，減少胚胎移植數量，降低多胎的發生率，降低患者的治療費用，避免了新鮮周期移植可能會出現的卵巢過度刺激綜合征。而且對于因子宮肌瘤、內膜病變等病情需要的患者，需要冷凍保存胚胎后，經過治療婦科疾病后再進行移植[1]。囊胚培養雖然會減少可用胚胎的數量，但是一定程度上可以淘汰掉染色體異常等質量差的胚胎，進一步篩選出發育潛能好的胚胎[4]。所以囊胚冷凍復蘇移植有重要的臨床應用價值。

根據理論模型，哺乳動物配子和胚胎可以冷凍儲存幾千年依舊保持生命力[5]。一項大型隊列研究結果表明，使用封閉的玻璃化冷凍載體冷凍保存胚胎的時長對存活、植入、活產、新生兒結局和先天畸形沒有明顯的負面影響[6]，但是，目前有很多實驗室使用開放的冷凍載體多過封閉載體[7]。之前有研究稱，當使用開放冷凍系統保存卵母細胞時，保存的時長對臨床結果沒有明顯的負面影響，但是沒有明確對新生兒結局的影響[8]。還有研究探討了使用開放系統玻璃化冷凍保存時長對卵裂期胚胎的影響，結果顯示保存時間5年內不影響胚胎存活率和妊娠結局[9]。最近的一項大型隊列研究報告結果顯示，使用開放系統長期保存囊胚對妊娠和新生兒結局沒有明顯負面影響，但是該研究的局限性在于最大儲存期為8年，而且并未將≥6年的資料單獨列出[10]。本研究旨在探討使用開放冷凍保存系統情況下，囊胚玻璃化冷凍保存時長對復蘇移植妊娠結局和新生兒結局的影響，進一步探討超過6年的玻璃化冷凍保存是否對胚胎的臨床結局有影響。

有研究表明冷凍復蘇細胞的存活率隨著低溫儲存時間的延長而下降[11]。本研究結果顯示，保存時間1～2年組的存活率最低，為97.19%，而5～6年組和≥6年組的存活率都為100%，說明冷凍復蘇胚胎的存活率并不會隨著儲存時間的延長而下降；雖然1～2年組的優胚率不是最低，但是還是稍稍低于總體優胚率，所以各組冷凍復蘇胚胎的存活率可能與胚胎的質量或者其他因素有關系。但由于本中心絕大多數冷凍方式是兩個胚胎冷凍在一個載桿內，而且復蘇后的培養也為集合培養，無法準確地追蹤不同胚胎的復蘇存活情況，所以無法進一步分析影響胚胎復蘇存活率的因素。收集更多單胚胎冷凍復蘇移植的資料，并分析其復蘇存活率的影響因素是我們今后的研究方向。

本研究中各組臨床妊娠率和活產率在不同冷凍保存時間組有差異，由于患者基礎情況中取卵年齡、移植年齡和移植優胚率都有差異，所以并不能判斷是否是玻璃化冷凍保存時長的差別導致了各組妊娠率和活產率的差異。于是進一步使用二分類Logistic回歸分析影響妊娠率和活產率的因素。結果顯示，取卵年齡、移植年齡和冷凍保存時長對妊娠率沒有顯著影響，而增加移植D5胚胎和優質胚胎數量可以提高妊娠率，與以往研究D5凍融囊胚的臨床妊娠率顯著高于D6凍融囊胚臨床妊娠率[12]的結論一致。取卵年齡、冷凍保存時長對活產率沒有顯著影響，而降低移植年齡、增加移植D5胚胎和優質胚胎數量可以提高活產率，與以往研究中活產率與囊胚冷凍日期(D5或D6)有關而與冷凍保存時間長短無關的結論一致[10]。但是在其他研究中囊胚直徑[10，13]、既往胚胎移植次數[10，14]已經被證明與胚胎移植后的活產有關。在本研究中這些數據因資料的缺失并沒有提供，今后可以收集這方面資料，完善研究。對于≥6年組的資料，其優胚率(84.42%)遠高于總體優胚率(69.56%)，所以臨床妊娠率(59.10%)和活產率(54.55%)均高于總體臨床妊娠率(56.11%)和活產率(47.22%)。

此外，本研究還發現使用開放性載體玻璃化冷凍保存囊胚的時長對新生兒結局沒有負面影響。各凍存時長組間出生缺陷率、單胎出生體重、出生身長和孕天數沒有統計學差異，而且≥6年組的出生缺陷發生率低于其他各組。以往的研究中報道過胚胎冷凍保存會增加孕周增長的風險，可能與表觀遺傳修飾和胚胎培養環境的變化有關[15]，但是本研究結果表明，各組之間的孕天數并沒有明顯的差異，冷凍保存時長的延長并沒有增加孕天數，≥6年組的孕天數(267.72±13.84)d，甚至略低于其他各組。

玻璃化冷凍與程序冷凍相比，需要設備少，節省人力，胚胎復蘇存活率高[16]，越來越多的生殖中心使用這種方法冷凍胚胎。但是由于玻璃化冷凍采用的冷凍保護劑濃度高，一直以來都有對于安全性的顧慮。雖然國內外還未有玻璃化冷凍復蘇周期出生缺陷增多的報道[17]，但是動物研究表明，玻璃化會影響基因的表達和表觀遺傳狀態，包括在牛和小鼠玻璃化囊胚中降低啟動子甲基化[18-19]。所以對玻璃化冷凍復蘇周期出生胎兒進行長期隨訪，從而進一步研究其安全性是今后研究的方向。

在實際工作中，還有很多因素可能會影響到冷凍胚胎的復蘇結果，例如冷凍保存過程中反復打開液氮儲存罐、冷凍載體的更新換代、冷凍復蘇操作程序的改進等等。本研究都沒有排除這些因素對結果的影響。本研究的另一個局限是其回顧性，可能會增加患者選擇的偏倚。

綜上所述，基于目前我們的研究，使用開放性載體玻璃化冷凍保存囊胚的時長對復蘇后移植的妊娠結局和新生兒結局沒有明顯影響。囊胚冷凍日期和囊胚質量才是影響臨床結局的因素。囊胚經過玻璃化冷凍并進行6年以上長期冷凍保存，臨床結局未產生明顯負面影響。