ICSI對高齡非男性因素不孕患者生育結局的影響

朱家紅，劉衛衛，王江，韓偉，黃國寧

(重慶市婦幼保健院遺傳與生殖研究所，重慶 400013)

ICSI是治療嚴重男性不育癥最有效的方式，能夠使受精率大幅提高且臨床結局得到顯著改善。自ICSI開始應用以來，其使用率不斷增高且應用指征也越來越廣泛[1]。文獻報道歐洲IVF監管中心統計的2014年39個國家1 279個生殖中心共進行了508 433例新鮮周期，其中ICSI占比為71.3%，呈逐年上升趨勢[2]。此外，ICSI除了廣泛應用到男性不育癥的治療外，已擴大應用到胚胎植入前遺傳學檢測、≥2次輔助生殖技術(ART)助孕失敗、受精失敗或受精不良、高齡、獲卵數少等原因引起的不孕癥以及不明原因不孕癥患者。當前國內外學術界均對ICSI指征是否應該擴大到這些因素存在較大爭議，有些文獻認為ICSI可改善高齡患者的受精率和胚胎質量[3]，臨床結局也更好[4]；然而有些文獻認為ICSI不能改善臨床結局[5]；甚至有些文獻認為高齡患者卵母細胞質量較差，ICSI的侵入性操作會使臨床結局更差[6]。ICSI對于高齡非男性因素不孕患者臨床應用結局的影響，相關文獻報道較少，需要更多的研究來探討ICSI治療的應用范圍。目前比較普遍認可將35歲以上的婦女定義為生育高齡婦女，大多數生殖中心35～37歲婦女ART助孕的成功率呈緩降趨勢，≥38歲的高齡女性活產率明顯下降，流產率顯著增高。本研究對高齡(≥38歲)、非男性不孕因素患者行ICSI和常規IVF助孕的臨床結局進行統計分析，探討ICSI的應用范圍。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2016～2018年間在重慶市婦幼保健院遺傳與生殖研究所接受ART治療的高齡、非男性因素不孕患者IVF或ICSI的臨床結局資料。入組標準：(1)行微刺激方案；(2)女性年齡≥38歲；(3)男方精液正常、行IVF或ICSI人工授精的周期。排除標準：男方精液異常的周期。

精液正常標準：根據WHO人類精液實驗室檢驗手冊(第5版)標準提示精液正常且無抗精子抗體，具體為：濃度>15×106/ml，總活力>40%，前向運動>32%，正常形態>4%，體積>1.5 ml。

二、研究方法

1.分組：根據受精方式分為ICSI組和IVF組。前次IVF授精無2PN胚胎故取消周期再次ICSI助孕的納入ICSI組(189例，共334個周期)；選擇同期、與ICSI組年齡及獲卵數條件平衡的189例無受精問題取消史的患者為IVF組(共325個周期)。

2.人工授精及培養：患者接受克羅米芬微刺激促排卵、HCG注射后36 h取卵，將獲得的卵母細胞培養2～4 h后行人工授精。ICSI授精前脫顆粒，選擇MⅡ期卵母細胞行ICSI授精。ICSI操作：精子制動后吸入注射針，使精子頭部位于注射針尖端，并移入含有卵母細胞的微滴中，固定針固定卵母細胞，使第一極體位置位于11～12點位置或者6點位置，注射針穿過透明帶進入卵胞質內，回吸胞漿液至卵母細胞破膜后將精子緩慢注入卵母細胞中心區域，再緩慢退出注射針。IVF授精：采用50 μl微滴受精法，使用巴斯吸管以約1萬條精子/50 μl的密度加精入受精皿微滴中，每微滴加1枚卵母細胞。受精后18～20 h觀察原核情況，培養至第3天(D3)根據形態學評估選擇可用胚胎行玻璃化冷凍保存待凍融胚胎移植(FET)備用。

3.觀察指標：統計IVF或ICSI后2PN受精率、優胚率、周期取消率及冷凍率，FET后的流產率、活產率及新生兒出生結局。IVF中2PN受精率=D1出現2PN卵子數/IVF加精卵子總數×100%；ICSI中2PN受精率=D1出現2PN卵子數/注射MⅡ卵子總數×100%；優胚率=優質胚胎數/正常受精卵裂胚胎數×100%；周期取消率=取消周期數/采卵周期數×100%；冷凍率=冷凍胚胎數/2PN卵裂胚胎數×100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；活產率=活產周期數/移植周期數×100%；早產率=早產(妊娠滿28周至不足37周分娩)周期數/活產周期數×100%；低體重出生率=低體重出生兒(出生時體重<2 500 g)數/總出生胎兒數×100%。

三、統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，組間均數比較符合正態分布的采用t檢驗，不符合正態分布的采用秩和檢驗；率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、兩組患者的基本資料比較

ICSI組189例患者共334個周期，IVF組189例患者共325個周期；ICSI組女性平均年齡(41.86±2.26)歲(38～52歲)，IVF組女性平均年齡(42.08±2.62)歲(38～51歲)。兩組之間除了ICSI組的不孕年限顯著高于IVF組(P<0.05)外，其余指標如平均年齡、體重指數(BMI)、Gn總量、Gn天數和獲卵數比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者受精后結局比較

ICSI組中由于異常卵或未成熟卵取消8個周期，實際326個周期行ICSI。IVF組實際受精325周期。受精后ICSI和IVF組由于無2PN胚胎分別取消周期31個和36個，由于胚胎質量差而無可移植胚胎分別取消周期44個和48個；IVF組由于異常卵或未成熟卵取消7個周期。ICSI組MⅡ卵率顯著低于IVF組(P<0.05)，但2PN受精率和2PN卵裂率顯著高于IVF組(P<0.05)；兩組的胚胎冷凍率、優質胚胎率、取消周期率比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者的基本資料比較(-±s)

注：與IVF組比較，*P<0.05

表2 ICSI組和IVF組受精結局比較(%)

注：與IVF組比較，*P<0.05

三、兩組患者FET后臨床結局比較

成功行FET的ICSI組和IVF組兩組之間的年齡、平均移植胚胎數和子宮內膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)；FET后兩組間的著床率、流產率和活產率也均無顯著性差異(P>0.05)；ICSI組由于兩例雙胎活產，低體重出生率和早產率均略高于IVF組，但無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 FET后ICSI組和IVF組臨床結局比較[(-±s)，%]

討 論

本中心對于女性高齡患者通常采用微刺激方案，由于高齡患者通常卵巢儲備功能低下、獲卵數少，并且隨著年齡增加卵母細胞質量顯著降低，更容易發生不受精或異常受精，發育潛能較低，可利用胚胎數少，導致臨床結局差甚至取消周期。因此選擇合適的授精方式，提高正常受精胚胎數量和質量是改善此類患者結局的關鍵。

一、ICSI不能排除受精后無2PN胚胎取消周期的風險

受精過程機制復雜，主要與卵母細胞的質量、精-卵結合過程、培養環境及體外操作相關。文獻表明男方精液檢查結果正常的不孕患者將近41%存在精子不能結合、穿透透明帶或透明帶功能異常[7]。此類患者再次改行ICSI助孕可顯著改善其受精結局，與本文ICSI組統計結果一致。說明ICSI可克服年齡相關的精卵結合異常、卵母細胞透明帶功能異常引起的不受精或多精受精情況，對于此類患者ICSI是有效的，且本研究結果顯示ICSI組可獲得的臨床結局與IVF組無顯著性差別。本研究結果顯示IVF組受精后無2PN胚胎取消周期率為11.08%(36/325)，而ICSI組的為9.28%(31/334)，說明ICSI仍不能排除高齡非男性因素不孕患者再次助孕ICSI受精后2PN胚胎取消周期的風險。

二、卵母細胞質量是影響受精的關鍵

本研究結果顯示IVF組MⅡ卵率顯著高于ICSI組，但2PN率卻顯著降低，0PN率顯著增高，兩組之間的異常受精率無顯著性差異。可能的原因是IVF組脫顆粒時間更晚，未成熟的卵母細胞在期間培養成熟并參與了受精的過程。文獻表明卵母細胞成熟度與其受精能力密切相關，如卵母細胞中低拷貝數線粒體DNA、紡錘體功能異常、皮質顆粒分布異常以及Ca2+通道異常導致卵母細胞激活失敗均可導致不受精[8-9]。不成熟的卵母細胞多精受精率高達32%～42%，而成熟卵母細胞發生率僅6%左右[9]。IVF異常受精最常見的原因是透明帶功能的異常導致多精受精，還可能是精子或卵母細胞為非單倍體配子。ICSI異常受精主要為單原核合子的形成，即孤雌生殖激活，與卵母細胞的成熟度以及ICSI操作過程中Ca2+水平的變化繼發引起。因此對于高齡患者改善卵母細胞質量才是影響受精和臨床結局的關鍵。

三、ICSI不能改善高齡非男性因素不孕患者的胚胎質量和臨床結局

ICSI為侵入性操作，可能對胚胎造成損傷影響胚胎發育[10]，甚至導致卵母細胞壞死，本研究中ICSI后卵母細胞壞死率為5.25%(32/610)，其對胚胎室操作人員技術要求較高。有文獻認為ICSI可提高高齡非男性因素患者的受精率和優質胚胎的質量[11]，原因是ICSI避免了卵母細胞與大量精子一起培養的過程，精子會產生多種活性氧，這些活性氧與胚胎的損害相關[12]。但本研究結果中兩組之間的優胚率及胚胎冷凍率無顯著性差別，ICSI組正常受精率顯著升高的原因可能是ICSI前已排除不成熟的卵母細胞，這與文獻報道[13-15]的受精方式與胚胎質量無關一致，甚至有文獻表明ICSI用于高齡患者更容易發生生化妊娠流產[16]，會導致其臨床結局更差[5]，相反選擇IVF助孕方式可能更有益于胚胎的發育[17]。說明ICSI并不能改善與年齡相關卵母細胞的質量下降帶來的受精失敗或異常受精，不應將單純高齡或獲卵數少作為ICSI的指征。

綜上所述，本研究建議高齡非男性因素不孕患者首次助孕應選擇IVF授精方式，而前次無2PN胚胎取消周期史的患者再次助孕選擇ICSI可以有效改善妊娠結局。