基于卵母細胞線粒體探討早發性卵巢功能不全發生機制

朱軼軒，董曉英

(首都醫科大學 1.基礎醫學院，2.中醫藥學院，北京 100069)

卵巢功能減退是導致女性生活質量下降的重要因素之一，其發病機制復雜且缺乏有效臨床治療手段，是醫學界持續探索的重點領域之一。近年來，隨著有關領域研究的開展，國內外學者對卵巢功能減退有了更加全面、客觀的認識。早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是目前醫學界公認的卵巢功能減退的重要階段之一，2016年才被正式提出，并在不久之后取代了“原發性卵巢功能不全”，逐漸被接受應用。

根據《早發性卵巢功能不全臨床診療中國專家共識》，早發性卵巢功能不全是指女性在40歲之前由于卵巢生理功能喪失引發的一系列異常表現的臨床綜合征[1]。其通常特征為低雌激素狀態導致的月經稀發或閉經、潮熱、盜汗、陰道干燥、性交痛、關節痛、泌尿系感染、焦慮、不孕癥、認知功能異常等[2]，并伴有高水平FSH、LH和低水平E2[3]。POI的診斷標準：(1)染色體正常，以往有過正常月經；(2)小于40歲；(3)月經稀發或停經至少4個月以上；(4)4～6周內，至少2次血清基礎FSH>25 U/L[4]。約1%的40歲以下女性患有POI，對于POI患者來說，生育率下降是最嚴重的問題之一，患者自然妊娠的幾率非常小，通常在4%～5%之間，對于當代醫學來說，POI的治療是一個重大挑戰[5]。

卵母細胞發育異常是POI的重要發病原因之一，其發育過程與卵母細胞線粒體有著密切聯系。本文旨在通過探討卵母細胞線粒體與POI的聯系，為POI的治療提供新思路。

一、卵母細胞線粒體功能及損傷機制概述

1.卵母細胞線粒體的結構和功能：線粒體是生物細胞內一短棒狀細胞器，由外向內依次有線粒體外膜、線粒體外室、線粒體內膜、線粒體內室等結構。線粒體內室中一般含有基質顆粒、線粒體脫氧核糖核酸(Mitochondrial Deoxyribonucleic Acid，mtDNA)、線粒體核糖核酸(Mitochondrial Ribonucleic Acid，mtRNA)和其他參與呼吸鏈的各元件。卵母細胞線粒體是卵母細胞進行氧化代謝的場所，負責卵母細胞有氧呼吸，產生ATP，為卵母細胞的成熟和受精提供能量，對卵母細胞的正常發育增殖具有重要意義，同時，卵母細胞線粒體DNA與呼吸鏈存在一定聯系，其突變可能會使卵母細胞代謝功能受損而死亡。因此，卵母細胞線粒體結構和功能異常可能是許多卵巢相關疾病的重要發病原因(圖1)。

圖1 線粒體的生理特征示意圖

2.卵母細胞線粒體損傷的原因：機體的新陳代謝通常會產生具有高度活性的氧自由基，正常情況下，氧自由基的產生和清除會在機體的調控下維持平衡以實現體內氧化系統和抗氧化系統的相對穩定，而在病理情況下，機體生成過量的氧自由基使得抗氧化防御系統受損，氧自由基產生和清除的動態平衡遭到破壞，機體就會處于氧化應激狀態[6]。由于線粒體中，電子傳遞鏈將電子從代謝物轉移到氧氣中，并將提取的能量作為膜電位儲存起來，作為生成ATP或熱量所需的膜電位。氧化應激狀態下，生物膜易被氧自由基破壞從而改變膜的結構和活性，引起線粒體膜滲漏和通透性增加[7]。這些變化帶來的膜電位下降會使線粒體腫脹、線粒體嵴破壞或消失、基質不可見[8]。同時，氧自由基還能直接攻擊DNA等生物大分子，作用于DNA時，會導致DNA鏈斷裂，增加DNA的基因組不穩定性，改變細胞的基因表達[9]。卵母細胞mtDNA是典型的易受攻擊生物大分子，它缺少保護機制且修復系統受限，其中的嘌呤和嘧啶對氧自由基非常敏感，極易受到氧自由基侵襲而使DNA鏈斷裂，引起相關卵母細胞mtDNA基因控制的功能異常或缺失[10]。

二、卵母細胞線粒體與POI

1.線粒體異常通過影響顆粒細胞正常功能導致的POI：卵母細胞線粒體通過代謝為顆粒細胞提供能量，以維持其正常功能。顆粒細胞與卵母細胞之間存在著大量縫隙連接，并通過縫隙連接輸送營養物質和信號分子進入卵母細胞，如氨基酸、核苷酸等，以促進卵母細胞胞核與胞質成熟。因此，卵母細胞線粒體可以通過顆粒細胞調控相應的卵母細胞生理功能。當機體處于氧化應激狀態時，線粒體膜通透性增加，過多Ca2+流入線粒體內降低跨膜電位，同時活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)激增，二者共同作用誘導顆粒細胞凋亡[11]。隨著女性年齡增長，線粒體的老化會也會使線粒體自身的數量和內部結構發生不利改變，活性和功能降低，對顆粒細胞的供能減少[12]，還會導致線粒體產生的抗氧化酶或非酶性抗氧化物，如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶等減少，過剩氧自由基不能得到及時清除，機體的氧化系統處于優勢地位，顆粒細胞更容易受到ROS攻擊[13-14]。顆粒細胞中的細胞死亡配體和細胞死亡受體系統是卵泡顆粒細胞的關鍵存活因子或凋亡因子，充當著卵泡發育或閉鎖的誘導物[15]。當顆粒細胞凋亡時，卵母細胞會失去進行生理活動所需的信號和能量而停止發育，發生閉鎖，引起卵巢儲備功能下降(decreased ovarian reserve，DOR)。臨床資料表明，部分卵巢儲備功能問題的積累會進一步損傷卵巢的其他功能，引起POI[16]。

2.mtDNA異常引起的 POI：mtDNA是位于線粒體基質的雙鏈環狀DNA，其所有基因都位于該單一環狀DNA分子上。人體的mtDNA在ATP合成過程中不受組蛋白的保護幾乎裸露于線粒體基質中[17]，這使得它成為容易發生基因重組突變的部位。對于真核生物而言，線粒體基因組不同于核基因組，因為親代精子的mtDNA在受精的過程中不可以進入卵母細胞，子代mtDNA 全部來自于母系，不發生再結合，所以mtDNA的遺傳過程屬于母系遺傳[18]，因此，人體只能通過卵母細胞傳遞mtDNA攜帶的遺傳信息。卵母細胞mtDNA的拷貝數決定了細胞內線粒體的數量[19]，同時mtDNA又控制著呼吸鏈和氧化磷酸化體系[20]，可以說是卵母細胞線粒體的“中樞”。

實驗證明，隨著女性年齡的增長，卵母細胞內的mtDNA拷貝數會明顯減少，引起線粒體數量的下降、卵母細胞凋亡以及胚胎發育阻滯[21]。由于卵母細胞mtDNA呈低氧化磷酸化代謝狀態且缺少組蛋白的保護，相較于其他細胞的mtDNA更容易受到ROS攻擊[22-23]，尤其是在氧化應激狀態下，mtDNA發生缺失或突變的概率會大大增加[24]。mtDNA具有很多突變形式，最常見的是ΔmtDNA4977片段缺失，該片段控制著ATPase6、ATPase8、NADH脫氫酶亞基3(NADH dehydrogenase subunit 3，ND3)、ND4L、ND4、ND5等線粒體基因核苷酸，一經突變，通常會損傷mtDNA編碼的氧化磷酸化相關蛋白的合成[25-26]。

卵母細胞mtDNA拷貝數減少將引起線粒體數量下降甚至卵母細胞凋亡，這都會使線粒體功能減退進而導致卵母細胞因供能不足，無法正常完成生理活動[21]。mtDNA的重組突變可能會降低線粒體蛋白質的翻譯水平，使呼吸鏈產生一定的缺陷，阻礙線粒體發揮其正常功能[27]，同樣會影響卵母細胞的正常發育。若mtDNA的不利改變超出機體調節范圍，會加速卵母細胞衰老，降低卵母細胞質量，為POI埋下隱患(圖2)。

圖2 ROS攻擊mtDNA對細胞功能影響的示意圖

3.線粒體分裂和融合功能異常引發的POI：線粒體是一種高度動態的細胞器，它的正常工作需要分裂和融合來調節自身動態以完成線粒體內物質的交換，當線粒體結構出現異常，引發線粒體功能缺陷時，受損線粒體可與正常線粒體通過融合分裂作用互換內容，從而改善線粒體結構缺陷并恢復其正常功能[28]。因此，線粒體的分裂和融合功能是“重塑”線粒體的重要手段。

線粒體融合基因2(Mitofusin，Mfn2)是分布于線粒體外膜的融合蛋白之一，具有高度保守的線粒體跨膜GTP酶(guanosine triphosphate ase，GTPase)功能[29]。該基因控制著線粒體的融合功能。同時，細胞中還存在一種dynamin樣的GTPase分子(Dynamin 1 like，DNM1L)，該分子介導著線粒體的分裂[30]。這兩者對線粒體維持分裂和融合動態平衡有著重要意義。在卵母細胞中，正常水平的Mfn2表達能通過融合作用使卵母細胞線粒體的結構和功能維持正常，而DNM1L則能夠防止線粒體驟增聚團，二者共同作用保證了卵母細胞能夠順利進行代謝，防止卵巢功能受損[23]。

有研究發現，Mfn2蛋白和DNM1L表達量異常的小鼠，其卵巢組織內的ATP含量較低，而卵巢組織內ATP含量的降低通常伴隨著線粒體結構功能的變化[29]。實驗證明，Mfn2蛋白和DNM1L表達量異常的小鼠會因為卵母細胞線粒體融合與分裂失衡而導致線粒體結構出現異常，線粒體膜電勢下降，ATP合成減少，卵母細胞紡錘體的組裝和極體排放受阻，卵母細胞出現異常染色體排列和非整倍體，從而引發卵巢功能下降[24]。這種卵母細胞線粒體融合與分裂失衡容易在女性身上積累對卵母細胞的不利影響，引發POI。

三、基于改善卵母細胞線粒體的POI治療方法

卵母細胞線粒體結構和功能改變導致的卵母細胞代謝受損是引起POI的重要原因之一，因此，改善卵母細胞線粒體質量也是治療POI的有效手段之一。目前臨床上基于卵母細胞線粒體可用的POI治療方法包括胞漿移植、異體體細胞線粒體移植以及自體體細胞線粒體移植等[31]。

1.胞漿移植：是指將受精卵的細胞核轉移到另一女性的健康去核卵母細胞中進行細胞重組的一種治療方法，卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)是臨床上一種治療不孕的胞漿移植相關方法[2]。但是胞漿移植缺乏動物模型的驗證，移植成分復雜，不確定性較大，有關影響胞漿移植的因素如子線粒體功能、凋亡機制、遺傳、母體轉錄物的存活、蛋白質和離子等方面的研究報道較少[32]，難以付諸臨床應用。

2.異體體細胞線粒體移植：是指將不孕女性的線粒體更換為其他健康女性的線粒體的一種治療方法[33]，Cohen等[34]用顯微注射的方法將年輕婦女卵子5%～10%的細胞質注入體外受精反復失敗患者和生育年齡較大患者的卵子內，結果發現胚胎質量明顯改善，并有健康的胎兒出生。但是，因為這種治療方法的倫理爭議較大，實驗基數小，其安全性和可行性仍有待確定。

3.自體體細胞線粒體移植：是用自身其他組織內健康細胞線粒體更換卵母細胞線粒體的一種治療方案[35-37]。目前臨床上已證實自體卵丘顆粒細胞線粒體移植技術能顯著改善卵母細胞質量[38]。最近，梁曉燕教授團隊也在世界上首次利用“卵母細胞內注射自體骨髓細胞線粒體”技術為一患者改善了胚胎質量[39]，為自體體細胞線粒體移植治療方法提供了新思路。此外，還有培養卵原干細胞以獲得線粒體來源等新興技術[40]。

四、展望

線粒體是人體最重要的細胞器之一，越來越多的醫學研究發現線粒體與許多難以治療的疾病有著密切聯系。在卵巢內，卵母細胞數量、結構和功能的變化可以通過供能、氧化應激和凋亡等途徑影響卵巢功能引發POI。迄今為止，基于卵母細胞線粒體探討POI發病機制的研究尚處于起步階段，相關實驗無論是種類、規模還是精確性都還不足以完全支撐已有的POI發病機制理論，且臨床上的相關治療方案還沒有成熟。在未來的研究中，除了完善已有實驗，提高已有實驗的可信度和說服力外，還可以試著從卵母細胞線粒體區別于其他細胞線粒體的獨特性入手，通過更多方面的實驗探索針對線粒體異常引發的卵巢相關疾病的個性治療方案。或者可以研究對卵母細胞線粒體更精準的物理操作方案，填補POI治療領域的相關空白。