甲狀腺乳頭狀癌中TZAP的表達及與臨床病理特征的關系

楊 帆，申國文，周 晨，楊 揚，段晶玲，肖勝軍，張小玲

甲狀腺癌是最常見的內分泌腫瘤，2018年全球甲狀腺癌發病人數約56.7萬，約占所有癌癥發病的3%[1]。甲狀腺癌的主要組織學類型包括乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌和未 分化癌[2]，其中乳頭狀癌發病率最高，占所有甲狀腺癌的70%以上[3]。近年甲狀腺癌發生率在全球范圍內快速上升[4]。

端粒鋅指相關蛋白(telomeric zinc finger-associated protein, TZAP)是由ZBTB48基因編碼的蛋白。TZAP蛋白通過直接結合端粒DNA雙鏈的TTAGGG重復序列，負性調控端粒長度，誘導細胞衰老[5]。此外，TZAP還可以發揮轉錄因子的功能，促進p14ARF的表達，進而抑制細胞增殖[6]。TZAP與端粒相關疾病密切相關，然而在腫瘤中的研究鮮見報道[7]。本文采用免疫組化EnVision法檢測甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常組織中TZAP的表達，并分析其與臨床病理特征的關系，探討TZAP在甲狀腺乳頭狀癌發生、發展中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2017年12月桂林醫學院第二附屬醫院存檔的71例甲狀腺乳頭狀癌組織納入觀察，納入條件：取患者未行放、化療及免疫治療時的手術切除標本；術后病理確診為甲狀腺乳頭狀癌，不考慮腫瘤大小或是否轉移；本實驗經桂林醫學院附屬醫院倫理委員會批準，患者及家屬知情并簽署同意書。排除標準：臨床資料不完整者；合并其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。

1.2 免疫組化采用免疫組化EnVision法染色，手術標本經石蠟包埋，4 μm厚切片，二甲苯脫蠟至水，流水沖洗10 min，檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復3 min，室溫下自然冷卻后，3%雙氧水孵育10 min，PBS沖洗3次×3 min，TZAP兔多克隆抗體(AB_2649779，上海賽默飛科技)(1 ∶100稀釋)4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗3次×3min，二抗(KIT-5220，福州邁新公司)37 ℃孵育30 min，DAB顯色5 min。蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹脂封固。

1.3 結果判讀TZAP表達于細胞質和細胞核內，呈黃色或棕黃色顆粒。按陽性細胞著色強度計分：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞百分比計分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～75%為2分，>75%為3分；兩項得分結果相乘為最后得分：0分為陰性，其余為陽性。

1.4 統計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，甲狀腺乳頭狀癌和癌旁正常組織細胞核中TZAP的表達差異用Pearson χ2檢驗分析；TZAP核表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關性采用Spearman等級分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TZAP蛋白在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常組織中的表達TZAP蛋白在癌旁正常組織的細胞質和細胞核中均為陽性(71/71，100%)；與癌旁正常組織相比(圖1)，TZAP在甲狀腺乳頭狀癌組織的細胞核中表達下調(圖2、3)，甲狀腺乳頭狀癌中TZAP細胞質陽性率為100%(71/71)，細胞核陽性率為52.11%(37/71)，兩者表達差異有顯著性(χ2=42.113，P<0.001)。

圖1 癌旁正常組織濾泡上皮中TZAP呈細胞質和細胞核陽性，EnVision法 圖2 甲狀腺乳頭狀癌組織中TZAP呈細胞質和細胞核陽性，EnVision法

圖3 甲狀腺乳頭狀癌組織中TZAP呈細胞質陽性，細胞核陰性，EnVision法

2.2 TZAP蛋白表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關性TZAP蛋白表達與腫瘤大小(rs=-0.249，P=0.036)、TNM分期(rs=0.264，P=0.026)呈負相關；與淋巴結轉移(rs=-0.356，P=0.002)、甲狀腺外播散(rs=-0.250，P=0.035)呈正相關；腫瘤直徑≥1 cm、有甲狀腺外播散、有淋巴結轉移和TNM分期較高者TZAP陰性率較高(表1)。與患者年齡(P=0.421)、性別(P=0.892)、多灶性(P=0.206)及是否伴有橋本甲狀腺炎(P=0.459)無相關性(表1)。

表1 甲狀腺乳頭狀癌中TAZP蛋白表達與臨床病理特征的關系[n (%)]

3 討論

TZAP是端粒鋅指結合蛋白，由ZBTB48基因編碼，在染色體上定位于1p36。TAZP蛋白含有688個氨基酸，相對分子質量為7.7×104，在羧基端含有11個C2H2類型的鋅指結構，氨基端高度保守，在其氨基末端保守區與鋅指結構域之間存在呈酸性的反式激活區[8]。ZBTB48基因所在的染色體區域在多個人類惡性腫瘤中出現異常，包括重組(平滑肌瘤、白血病等)或刪失(神經母細胞瘤、黑色素瘤、嗜鉻細胞瘤、結腸癌、乳腺癌等)[5]，提示該基因可能是潛在的抑癌基因[9]。

TZAP可以直接結合到端粒的TTAGGG重復序列，可以觸發“端粒修剪”，導致端粒重復片段的刪除，使端粒長度變短[10]。端粒縮短能限制干細胞的復制能力[11]，調控細胞永生化和衰老之間的平衡，這些分子事件的調控異常都被認為是癌癥相關的關鍵分子事件[12]。以上數據提示TZAP對端粒的調控可能參與腫瘤的發生。

此外，TZAP也能作為轉錄因子調控相關靶基因的轉錄。TAZP能結合CDKN2A近端啟動子區域，激活其轉錄本ARF的表達，促進p14ARF蛋白的表達[6]。p14ARF能直接抑制細胞周期進展[13]，還能通過p53信號通路(ARF-MDM2-TP53-p21WAF/CDKN1A)誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡的發生。因此，TZAP能通過對端粒、細胞增殖和凋亡等的調控發揮抑癌作用。

本實驗采用免疫組化EnVision法檢測發現，在甲狀腺乳頭狀癌組織中，細胞核內TZAP表達下調，且其下調與進展期臨床病理特征相關(包括腫瘤體積大、淋巴結轉移、甲狀腺外播散、臨床進展期)；提示TZAP可能參與甲狀腺乳頭狀癌的發生、發展，其具體的機制有待進一步分析。同時，發現細胞質內TZAP表達無明確下調，提示胞質內TZAP可能具有與核內TZAP不同的功能。Uniprot數據庫發現TZAP蛋白除經典的7.7×104異構體外，還有4個潛在的小分子量的異構體，氨基酸長度128～310 aa(https://www.uniprot.org/uniprot/P10074#sequences)。不同的異構體可能存在不同的亞細胞定位和功能，提示核內定位的異構體具有抑瘤作用，而非胞質內異構體。不同剪切異構體在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及功能，有待于后續進一步分析。

總之，甲狀腺乳頭狀癌細胞核內TZAP表達下調，可能參與其發生、發展。