肝細(xì)胞癌中SETDB1的表達(dá)及臨床意義

李 征，夏朝霞，史靜怡，汪春年

肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌中最常見的病理類型，嚴(yán)重威脅人類生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國肝細(xì)胞癌新發(fā)及死亡病例占全球半數(shù)以上[1]。近年雖然針對原發(fā)性肝癌的診治取得一定進(jìn)展，但其術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍然是影響肝癌患者預(yù)后不良的重要因素，肝癌患者5年生存率僅有5%[2]。因此探索肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1屬于組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶SET家族中的一員，位于1號(hào)染色體上，參與組蛋白H3K9me3的甲基化[3-4]。研究表明，SETDB1在結(jié)腸癌、白血病等多種腫瘤中高表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲具有促進(jìn)作用[5-6]。本文采用qRT-PCR法檢測SETDB1 mRNA在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，旨在探討其在肝細(xì)胞癌中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集2016～2018年浙江省寧波市臨床病理診斷中心經(jīng)病理確診的原發(fā)性肝細(xì)胞癌64例，均為手術(shù)切除標(biāo)本。通過調(diào)閱檔案HE切片，每例挑選癌細(xì)胞含量>70%的蠟塊1個(gè)及配對癌旁(距病灶>1 cm以上)正常肝組織蠟塊1個(gè)，盡量避開出血、壞死區(qū)。64例肝細(xì)胞癌中，男性57例，女性7例。年齡40～80歲，平均59.1歲，中位年齡58.5歲。單個(gè)瘤體者55例，2個(gè)及以上瘤體者9例。腫瘤直徑1～18 cm不等，多個(gè)瘤體者取直徑總和，>5 cm者16例，≤5 cm者48例。低分化23例，中+高分化41例。伴肝硬化者37例，不伴肝硬化者27例。伴微血管侵犯(microvascular invasion, MVI)(M1或M2)者42例，不伴MVI者22例。pTNM分期：Ⅰ+Ⅱ期45例，Ⅲ+Ⅳ期19例。

1.2 主要試劑及儀器Luna Universal Probe One-Step qRT-PCR Kit(NEW ENGLAND BioLabs)；FFPE RNA提取試劑盒(OMEGA bio-tek)；qRT-PCR儀(美國ABI 7500)。SETDB1引物由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，上海生工生物公司合成；SETDB1上游引物：5′-CTATATGACTTCCGGCGGATGA-3′，下游引物：5′-GCATTGTCCGAAGGCAGAGA-3′；內(nèi)參GAPDH引物購自上海生工生物公司。

1.3 qRT-PCR檢測64對肝癌及癌旁正常組織蠟塊，每個(gè)樣本切5 μm厚4張，置于EP管中，按照試劑盒說明書步驟提取總RNA，并檢測濃度及純度，總RNA純度A260/A280在1.8～2.1之間為合格。每個(gè)樣本取1 μg RNA樣品進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，體系為20 μL，反應(yīng)條件：55 ℃、10 min逆轉(zhuǎn)錄；95 ℃、1 min預(yù)變性；95 ℃、10 s，60 ℃、1 min，合計(jì)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3孔。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SETDB1的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 SETDB1 mRNA在肝細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá)量qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，41例(64.06%)肝細(xì)胞癌組織中SETDB1 mRNA表達(dá)量高于癌旁正常組織。肝細(xì)胞癌與癌旁正常組織中SETDB1相對表達(dá)量分別為(1.658±1.287)、(1.233±1.070)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.917，P=0.005，圖1)。

圖1 SETDB1 mRNA在肝細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 SETDB1 mRNA表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系肝細(xì)胞癌組織中SETDB1 mRNA表達(dá)水平與腫瘤大小、MVI分型及pTNM分期有關(guān)；與患者性別、年齡、瘤體個(gè)數(shù)、腫瘤分化程度及是否伴有肝硬化無關(guān)。腫瘤直徑>5 cm者、伴有MVI(M1或M2)者及pTNM分期Ⅲ+Ⅳ者更易出現(xiàn)SETDB1表達(dá)上調(diào)(P<0.05，表1)。

3 討論

肝癌表觀遺傳變異在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[7]。研究報(bào)道SETDB1通過多種途徑介導(dǎo)基因的沉默而激發(fā)腫瘤的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤的生長與增殖[8-9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，SETDB1在肝癌中的表達(dá)明顯升高，與肝癌的進(jìn)展、侵襲及預(yù)后有關(guān)。Wong等[10]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄子測序技術(shù)對HBV相關(guān)的肝細(xì)胞癌中591個(gè)表觀遺傳調(diào)節(jié)子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)SETDB1是肝細(xì)胞癌中上調(diào)最顯著的表觀遺傳調(diào)節(jié)子，其上調(diào)機(jī)制可能涉及多個(gè)階段：染色體1q21上SETDB1基因拷貝數(shù)增加，可調(diào)控多個(gè)下游靶基因；轉(zhuǎn)錄水平SP1轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)SETDB1活性；轉(zhuǎn)錄后水平miR-29與SETDB1呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，沉默SETDB1能抑制肝細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲能力。臨床病理分析表明SETDB1上調(diào)與肝細(xì)胞癌疾病進(jìn)展、癌侵襲性強(qiáng)及預(yù)后差相關(guān)。Fei等[11]研究發(fā)現(xiàn)SETDB1能通過p53甲基化調(diào)節(jié)肝細(xì)胞生長。Shao等[12]研究發(fā)現(xiàn)SETDB1是miR-621的直接靶基因，miR-621通過抑制SETDB1，激活p53途徑，最終增強(qiáng)肝細(xì)胞癌的放射敏感性。Zhang等[13]研究顯示SETDB1與Tiam1作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。陳靜等[14]通過敲除SETDB1研究其對肝癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖凋亡能力的影響，結(jié)果顯示下調(diào)SETDB1能通過H3在K9位點(diǎn)的甲基化發(fā)揮抗腫瘤生長作用。

表1 肝細(xì)胞癌中SETDB1 mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)，對64例原發(fā)性肝細(xì)胞癌中癌組織和癌旁正常組織中SETDB1 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)SETDB1在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)。臨床病理相關(guān)性分析表明，腫瘤直徑>5 cm者、伴有MVI(M1或M2)者及pTNM分期Ⅲ+Ⅳ者更易出現(xiàn)SETDB1 表達(dá)上調(diào)。陳靜等[14]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌中SETDB1蛋白高表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)，與本組結(jié)果相似；雖然他們并未發(fā)現(xiàn)SETDB1蛋白表達(dá)與pTNM分期有相關(guān)性，但結(jié)果顯示Ⅲ+Ⅳ期者SETDB1蛋白陽性率高于Ⅰ+Ⅱ期者，與本組結(jié)果相符。有研究發(fā)現(xiàn)，伴有MVI患者往往腫瘤體積更大，且生存期較短[15]。因此，本組發(fā)現(xiàn)SETDB1表達(dá)與MVI及腫瘤大小有相關(guān)性，提示SETDB1表達(dá)上調(diào)可能與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后差相關(guān)，檢測肝細(xì)胞癌中SETDB1表達(dá)水平對評估臨床腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后有一定價(jià)值。

綜上所述，SETDB1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)上調(diào)與腫瘤大小、MVI及pTNM分期密切相關(guān)，提示SETDB1是肝細(xì)胞癌侵襲和預(yù)后不良的生物學(xué)指標(biāo)。對于SETDB1表達(dá)與肝細(xì)胞癌其他臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系還需擴(kuò)大樣本量，并結(jié)合SETDB1蛋白表達(dá)進(jìn)一步分析。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道SETDB1與肝細(xì)胞癌疾病進(jìn)展、侵襲性及預(yù)后密切相關(guān)，但其在肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。隨著研究的逐漸深入，SETDB1有望成為肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)。