PITX2 啟動子甲基化及其與膀胱癌臨床病理的關(guān)系

王銀蕾，楊 瀚，高 杰，王玉杰，沈 沖，吳周亮，田大偉，胡海龍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室，天津300211)

膀胱癌近些年發(fā)病率逐漸增高，排在全球癌癥發(fā)病率的第9 位[1]。它的發(fā)生率和死亡率在我國泌尿系統(tǒng)癌癥致死率中長期站于首位，癌癥的根本挑戰(zhàn)之一是檢測癌癥進(jìn)展過程中基因的變化和導(dǎo)致這些變化的調(diào)節(jié)因子。目前已知異常表觀遺傳修飾在基因表達(dá)的改變中起關(guān)鍵作用，可誘導(dǎo)腫瘤的形成。特異性基因中啟動子區(qū)域的異常甲基化作為表觀遺傳學(xué)中重要一項，是癌癥形成和發(fā)展的關(guān)鍵。

PITX2 屬于Paired-Bicoied 同型盒蛋白家族,并與PITX1 和PITX3 構(gòu)成PITX 亞家族。所屬基因位于人4 號染色體。這種蛋白作為一個轉(zhuǎn)錄因子[2-3]，調(diào)節(jié)膠原賴氨酰羥化酶基因的表達(dá)。其蛋白質(zhì)包含兩個結(jié)構(gòu)域:2 型同型盒結(jié)構(gòu)域（homeobox_2）和

OAR 結(jié)構(gòu)域。同型盒是一種包含60 個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,這種結(jié)構(gòu)域在包括脊椎動物在內(nèi)的各物種中都極為保守,可通過其“螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋”（helix-turn-helix，HTH）結(jié)構(gòu)與特異性的DNA位點結(jié)合，包含這種結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)大部分是轉(zhuǎn)錄因子,并在個體發(fā)育過程中間發(fā)揮著重要作用。在正常組織中PITX2 通過調(diào)節(jié)cyclin D2[4]，cyclin D1[5]和c-myc[5]表達(dá)參與了眼睛，牙齒和腹部器官的發(fā)育，所屬基因突變會導(dǎo)致Axenfeld-Rieger 綜合征（ARS）、Peters 綜合征、法洛四聯(lián)癥以及心室間隔缺損等先天性心臟病[6-8]。PITX2 啟動子基因序列，可見聚集的回文型CpG（也稱為CpG 島）[9-10]。CpG 島的大小范圍為0.5 至5 kb，G：C 含量至少為55%，CpG至GpC 頻率至少為0.65：10，CpG 島與約50%的哺乳動物基因相關(guān)，大部分位于基因的啟動子和第一外顯子區(qū)域，盡管偶爾也發(fā)現(xiàn)它們在3′末端[11]。正常的成年健康組織中，CpG 島幾乎不是甲基化的，但在癌癥中呈現(xiàn)不同程度的甲基化[12]。PITX2 啟動子區(qū)域的高CpG 島增加其高甲基化的概率cgtccactaa gggcggctgg aggctgggga gtcccggcga cggcggcggg ggcatccgtg gattaggatg tggattgcag gacagacctt tgtttggtca cattcgcgac agggattggg ggaagggtcg tcctccttcg agatcacgct ggatttttat agactcgcct taaaagggct cactcttcac agggttaatt tatacggctt tcgaggaata ttaggacttt taagacgctg…aatcggtatt agcggaatga agactttggg gccttggaaa tttttaaaga ggtttacttt tttttttttt ttttaataaa acaaaacccg aggataggcc aaagataccg agagaagaaa aggtgcctgc tagtaacagg tgagggatgg aagggggtgg cggggagaaa gcccccagac ggcggatcgt ctgcgcgggg ttcctgcccc aggcctggcg aacctctgag cgctcaagga gcacggcggc agtgcgctga ggccagtgag gcctgggcgc ctccgggccc aacctcgagc tcgccatttt tgaacccaag cggggaaggt…

1 材料與方法

1.1 人群選擇 2010-2018 年在我院行全膀胱切除術(shù)33 例患者，取膀胱癌組織和癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)。根據(jù)WHO 2016 膀胱尿路上皮癌惡性程度分級系統(tǒng)將腫瘤的組織學(xué)亞型分類[13]。上述參加者已采取書面知情同意書，并且使用這些臨床樣本已獲天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會的審批（倫理編號KY2018K083）。

1.2 細(xì)胞系選擇 永生化膀胱上皮細(xì)胞系（SVHUC-1）和3 種膀胱癌細(xì)胞系（EJ、HTB-9、低度惡性）、（T24、高度惡性），均由天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室提供。所有細(xì)胞系均在含有10%胎牛血清（Gibico）青霉素-鏈霉素雙抗（Gibico）、RPMI1640培養(yǎng)基（Gibico）/F12K（Gibico）（SV-HUC-1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基）的25 cm2或75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并在37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄和PITX2 差異表達(dá)檢測 使用TRIzon（CWBIO,CW0580S）法提取組織、細(xì)胞RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiFiScript cDNA Synthesis Kit CWBIO）合成cDNA。用于QRT-PCR 測定的引物如下：正向：5′-GATCGTTAGTCGCGTAGT CG-3′和反向：5′-TCCAACTTTCTCGCTCGAT-3′。（引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成）RT-PCR 參數(shù)為94 ℃，5 min；35 個循環(huán)的95 ℃，30 s，58 ℃，30 s；并在72 ℃延伸10 min。qPCRmix（2×lightcycler 480 SYBR Green I Master,Roche）熒光定量PCR 儀（Life Technologies，ABI7900）。

1.4 免疫組化檢測PITX2 蛋白差異表達(dá) 細(xì)胞蛋白提取：75 cm2培養(yǎng)瓶細(xì)胞鋪滿80%，按說明書加入RIPA 和PMSF（CWBIO，CW2334S），冰上孵育間斷搖勻30 min，4 ℃離心機(jī)離心機(jī)離心15 min。取上清；組織蛋白提取：液氮研磨黃豆大小組織，加入RIPA 和PMSF，相同方法。提取的蛋白95 ℃變性保存。

1.5 甲基化DNA 檢測 應(yīng)用甲基化DNA 檢測試劑盒（CWBIO，CW2140M） 純化在2.3 中提取的cDNA，再進(jìn)行甲基化的PCR 檢測。引物和方法同上。用于檢測33 例膀胱癌組織的PITX2 甲基化程度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 22.0軟件。GraphPad Prism 5.0 用于繪制所有圖形。配對學(xué)生t檢驗應(yīng)用于永生化膀胱上皮細(xì)胞系（SV-HUC）和3 種膀胱癌細(xì)胞系的甲基化程度的比較，而單因素方差分析用于多個病理亞組之間的比較。通過χ2檢驗檢查PITX2 表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線以評估PITX2 啟動子甲基化對腫瘤侵襲的診斷準(zhǔn)確性。使用Kaplan-Meier方法分析術(shù)后存活率，并使用對數(shù)秩檢驗評估存活曲線之間差異的顯著性水平。P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PITX2 差異表達(dá) 檢測PITX2 在SV-HUC-1和3 種膀胱癌細(xì)胞系的差異表達(dá)情況（圖1A），PITX2 在33 例膀胱癌組織與癌旁組織的差異表達(dá)（圖1B）。

2.2 蛋白水平上檢測PITX2 差異表達(dá) 免疫組化實驗檢測蛋白水平上PITX2 的差異表達(dá)，膀胱癌細(xì)胞系PITX2 表達(dá)明顯高于永生化膀胱上皮細(xì)胞系（圖2A），癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（圖2B）。

2.3 PITX2 啟動子甲基化差異檢測 在永生化細(xì)胞系和3 種膀胱癌細(xì)胞系中檢測PITX2 啟動子甲基化的差異表達(dá)（圖3A），同時在33 例膀胱癌組織和癌旁組織中驗證PITX2 啟動子甲基化的差異表達(dá)（P＜0.000 1，圖3B）。及癌組織中PITX2 甲基化程度與患者臨床參數(shù)的相關(guān)性（表1）。

2.4 PITX2 啟動子甲基化與膀胱癌臨床病理因素的相關(guān)性 33 例癌組織中PITX2 甲基化程度與患者臨床參數(shù)的相關(guān)性（表1）。

圖1 PITX2 差異表達(dá)Fig 1 PITX2 differential expression

圖2 蛋白水平上檢測PITX2 差異表達(dá)Fig 2 Detection of differential expression of PITX2 at protein level

圖3 PITX2 啟動子甲基化差異檢測Fig 3 PITX2 promoter methylation difference detection

表1 PITX2 啟動子甲基化與膀胱癌臨床病理因素的相關(guān)性Tab 1 Correlation between PITX2 promoter methylation and clinicopathological factors of bladder cancer

為了評估PITX2 啟動子甲基化對腫瘤侵襲（T2-T4 膀胱癌）的診斷價值，繪制了ROC 曲線。ROC 曲線下面積（AUC）為0.867，敏感性和特異性分別為0.653 和0.726（圖4A），表明PITX2 啟動子甲基化在腫瘤侵襲診斷中的適度準(zhǔn)確性。

PITX2 啟動子甲基化表達(dá)與患者存活率的相關(guān)性探討了PITX2 啟動子甲基化表達(dá)水平（高與低）與膀胱癌患者總體存活率的相關(guān)性。 Kaplan-Meier曲線顯示，與低PITX2 甲基化表達(dá)的腫瘤相比，高PITX2 甲基化表達(dá)的腫瘤與較短的總體存活相關(guān)。在這項研究中，中位隨訪時間為24 個月。高表達(dá)組的中位總生存時間為22.5 個月，而低表達(dá)組為34個月（圖4B，P=0.001 1）。

圖4 PITX2 啟動子甲基化在預(yù)測腫瘤侵襲性和預(yù)后上的作用Fig 4 The role of PITX2 promoter methylation in predicting tumor invasion and prognosis

3 討論

基因啟動子甲基化在預(yù)測癌癥發(fā)生和預(yù)后中發(fā)揮作用。如非小細(xì)胞肺癌[14]，乳腺癌[15]和前列腺癌[16]的研究所示，與肺腺癌相比，SHOX2 和PITX2 的DNA 甲基化在肺鱗狀細(xì)胞癌中顯著更高，并且與吸煙史有很大相關(guān)性，能夠?qū)HOX2 和PITX2 的DNA 甲基化描述為用于檢測肺癌的生物標(biāo)志物。乳腺癌中，RASSF1A 和PITX2 的CpG 島啟動子的高甲基化可能在乳腺癌發(fā)病機(jī)制的早期階段起重要作用，并且與年齡增加（P＜0.05），腫瘤分級（P＜0.000 1）和分期（P＜0.000 1）顯著相關(guān)。在前列腺癌中，PITX2甲基化是生化復(fù)發(fā)的最強預(yù)測因子，為根治性前列腺切除術(shù)治療患者，尤其是中度風(fēng)險患者（Gleason 7）提供預(yù)后信息。腫瘤中PITX2 甲基化程度大于中位數(shù)的患者在術(shù)后8 年內(nèi)發(fā)生生化復(fù)發(fā)的可能性是甲基化程度低于平均水平的患者的4 倍。這些研究都說明PITX2 啟動子甲基化能夠成為腫瘤診斷以及預(yù)后預(yù)測的可靠指標(biāo)。本研究主要方向是其在膀胱癌中PITX2 啟動子甲基化的診斷和預(yù)測價值。

啟動子區(qū)域高CpG 島是甲基化的基礎(chǔ)，PITX2啟動子區(qū)域CpG 島分布明顯高于其他基因，Salem等[17]分子機(jī)制研究顯示，位于轉(zhuǎn)錄單位不同區(qū)域的CpG 島的定量掃描提示可能解釋在癌癥進(jìn)展期間如何實現(xiàn)啟動子甲基化的變化等級。每一個CpG 島是獨立運作，但是表明CpG 島甲基化，其轉(zhuǎn)錄起始位點下游的DNA 區(qū)域中發(fā)生CpG 島甲基化會更加頻繁，程度也隨著腫瘤惡性度增高而不斷加深，并且腫瘤增長速度也會越快，如果檢測非浸潤性乳頭狀瘤的基因甲基化改變更頻繁，這種腫瘤更可能發(fā)展為侵襲性疾病，這也在分子水平解釋為什么癌癥分子突變存在級聯(lián)現(xiàn)象。

使用QRT-PCR 檢測了永久化膀胱上皮細(xì)胞系（SV-HUC）和3 種膀胱癌細(xì)胞系PITX2 啟動子甲基化程度，高惡性度的T24 細(xì)胞系顯示其甲基化程度比低惡度膀胱癌細(xì)胞系（EJ、5637）要高。雖然檢測PITX2 啟動子甲基化中，膀胱癌細(xì)胞系比永生化膀胱上皮細(xì)胞系高幾十到一百多倍，但是在檢測PITX2 表達(dá)時發(fā)現(xiàn)，這一差異又增高了將近4 倍，癌組織與癌旁正常組織中PITX2 表達(dá)差異更加明顯。這說明PITX2 甲基化可能促進(jìn)PITX2 的表達(dá)。免疫組化同時顯示PITX2 蛋白水平上表達(dá)，無論在細(xì)胞中還是組織中，癌中表達(dá)均高于正常膀胱細(xì)胞或組織。在成釉細(xì)胞癌中，PITX2 作為Wnt/β-catenin 途徑下游調(diào)節(jié)信號，其高表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤增長，作為肌動蛋白-肌球蛋白重組反應(yīng)上游調(diào)節(jié)信號促進(jìn)腫瘤侵襲[18]。在宮頸癌中，PITX2 與HPV E6 蛋白結(jié)合并抑制細(xì)胞中p53 的降解，從而導(dǎo)致p53 積聚和細(xì)胞周期阻滯于G1/G0 期，通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤增長[19]。在淋巴結(jié)陽性結(jié)直腸癌中，β-catenin/LEF1/PITX2 復(fù)合物能夠激活LEF1 表達(dá)，近而激活上皮基因FN1 促進(jìn)纖維蛋白合成，這一蛋白主要促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[20]。在膀胱癌中，Wnt/β-catenin途徑在促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和遷移中早已占有一席之地，其調(diào)節(jié)PITX2 的高表達(dá)，并調(diào)節(jié)下游Cyclin-D1 和C-myc 發(fā)揮作用，但PITX2 高表達(dá)是否與其甲基化有關(guān)，還需要更深一步研究。

QRT-PCR 檢測33 例膀胱癌患者的腫瘤組織中PITX2 啟動子甲基化的表達(dá)。基于檢測的數(shù)據(jù)，PITX2 啟動子甲基化的表達(dá)水平在個體之間變化還是有的，并且觀察到與匹配的鄰近正常粘膜相比，膀胱腫瘤組織中甲基化表達(dá)顯著增高。重要的是，研究表明PITX2 啟動子甲基化的表達(dá)與腫瘤分級、大小和TNM 分類顯著相關(guān)，并且更具侵襲性的腫瘤傾向于更高的甲基化表達(dá)，暗示PITX2 啟動子區(qū)域甲基化在膀胱癌中的診斷作用。因此，采用ROC曲線來評估其在腫瘤侵襲預(yù)測中的表現(xiàn)。盡管特異性和敏感性結(jié)果僅支持PITX2 用于腫瘤侵襲診斷的適度功效。

研究中有人群樣本量過少，隨訪時間不足等問題，因此，在進(jìn)一步的研究中使用高甲基化或者沉默甲基化細(xì)胞系模型探索PITX2 啟動子甲基化在膀胱癌功能，提高樣本量和病人隨訪時間。探索PITX2 啟動子區(qū)域甲基化是否為隊列中膀胱癌患者5 年總生存的獨立預(yù)后因素。明確膀胱癌中PITX2啟動子甲基化在Wnt 信號通路中角色。總之，筆者的研究首次表明PITX2 啟動子甲基化與膀胱腫瘤侵襲、TNM 分類等相關(guān)，可能預(yù)測膀胱癌的發(fā)生和總體存活率。