水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54在骨干親本中的分布以及對穗頸瘟抗性的作用

宛柏杰，劉 凱，趙紹路，朱靜雯，劉艷艷，張桂云，朱國永，王愛民，唐紅生，孫明法，嚴國紅

(江蘇沿海地區農業科學研究所，江蘇 鹽城 224000)

【研究意義】稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的水稻重要病害之一，對水稻產量和品質有重要影響，嚴重時可造成減產40 %～50 %，甚至顆粒無收[1]。選育和利用抗病品種，是防治稻瘟病最經濟有效的方法之一，但由于稻瘟病菌存在多個生理小種以及生理小種不斷的分化，抗譜較窄的品種往往在推廣幾年后抗病性就可能出現降低[2-3]。育種實踐證明，將具有不同抗譜的稻瘟病抗性基因聚合到同一個品種中，可以有效提高品種抗稻瘟病的持久性[4]。在傳統育種中，水稻稻瘟病抗性育種主要依賴于接種鑒定和表型選擇，而且需要育種者具有幾年甚至十幾年的育種經驗，鑒定結果往往容易造成誤差，甚至抗性基因的丟失，選擇效率低，選育周期長[5]。近年來，隨著分子生物技術的發展，水稻抗性育種已經進入生物技術與常規技術相結合的階段，以分子標記輔助選擇、多基因聚合等分子育種技術已經成為抗性育種的主要方向[6]。【前人研究進展】目前研究發現，在不同抗病品種中，已經鑒定出80多個稻瘟病抗性基因，其中30多個抗稻瘟病基因已經被克隆[7]。這些基因成簇地分布于除第3 染色體外的其他染色體上[8-10]。隨著稻瘟病抗性基因Pi-b第一個被成功克隆，越來越多新的稻瘟病抗性基因通過圖位克隆、等位基因挖掘、無毒基因與抗性基因互作等策略得到分離。Pi-b基因位于水稻第2染色體長臂末端附近的區域，編碼由1251個氨基酸殘基組成的含1個核苷酸結合位點和富含亮氨酸重復的蛋白質[11-12]。Pi-ta基因位于水稻第12 染色體靠近著絲點附近的區域，包含2個外顯子和1個1463 bp的內含子，編碼1個長度為 928個氨基酸的細胞質膜受體蛋白[13]。Bryan等研究發現Pi-ta基因的編碼產物能與稻瘟病菌的無毒基因表達產物相互作用引發抗病反應[14]。Pi54定位于水稻第11染色體上，對稻瘟病菌具有廣譜抗性[15]。Sharma等克隆了Pi54基因，在抗病品種Tetep中，Pi54僅包含1個外顯子，編碼 1個由330氨基酸組成的NBS-LRR類抗病蛋白[16]。Pigm抗性基因來源于我國地方品種谷梅4號，由1對顯性基因控制，該基因抗譜廣，對9個來自中國不同品系的生理小種均表現出良好抗性[17]。宋兆強等對60 份品系進行了基因檢測，解析了稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi-km在稻瘟病抗性育種中的作用[18]。大量抗稻瘟病基因的定位與克隆，對通過分子標記輔助選擇培育具有持久抗性的水稻品種起到了極大地推動作用。【本研究切入點】本研究利用水稻稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54的分子標記對80份通過傳統育種方法選育出來的抗病材料進行基因檢測，并結合連續兩年人工穗頸瘟接種鑒定結果，對抗病基因進行穗頸瘟抗性評價。【擬解決的關鍵問題】明確不同抗病基因型對稻瘟病菌的抗病性，有針對性的進行抗性基因的聚合，為篩選廣譜抗稻瘟病水稻品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料為江蘇沿海地區農業科學研究所經過多年稻瘟病菌圃鑒定篩選出來的抗病育種骨干粳稻親本80份，依次編號為GP1～GP80。

1.2 稻瘟病抗性基因的標記檢測

DNA提取與稻瘟病基因功能標記的檢測參考范學軍等的方法[19]。抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54引物設計參照陳鋒等和呂學蓮等[20-21](表1)，利用這些功能和連鎖標記檢測試驗材料。利用Pi-ta引物檢測到1024 bp片段，并且NPi-ta引物擴增不出目的片段，說明材料含有Pi-ta基因；利用Pi-b引物檢測到365 bp片段，并且NPi-b引物擴增不出目的片段，說明材料含有Pi-b基因。而Pi-b引物檢測不出目的片段，但NPi-b引物擴增803 bp片段，說明該材料攜帶有感病基因；抗病基因Pigm引物可以擴增出856 bp大小的目的片段，說明材料中含有抗病基因Pigm，沒有擴增出目的基因片段，說明材料不含有Pigm基因；抗病基因Pi54標記為共顯性標記，擴增片段216 bp(抗)/359 bp(感)。

1.3 稻瘟病抗性鑒定與評價

1.3.1 抗性鑒定 試驗在本所南洋試驗基地進行，5月8日播種各試驗材料，30 d后移栽，單本載插，每區3行，每行8株，株行距13.3 cm×25.0 cm，整個生育期內不防治病害，蟲害防治和肥水管理參考大田生產。

抗性鑒定菌株為江蘇省農業科學院植物保護研究所提供，包括近年來江蘇省內稻瘟病菌優勢小種以及各群小種的代表菌株，2016 年接種鑒定的稻瘟病菌代表菌株: ZB7、ZC11、ZD5、ZE3、ZF1 和ZG1；2017年接種鑒定的稻瘟病菌代表菌株: ZB3、ZC11、ZD7、ZE3、ZF1 和ZG1。將稻瘟病菌株混合，在水稻孕穗至破口期，參照于苗苗等人工注射接種的方法[17]，進行水稻穗頸瘟的抗性鑒定，水稻成熟后進行水稻穗頸瘟的抗性調查。

1.3.2 抗性評價 齊穗后30 d調查每個株系的穗發病情況，調查與評價方法參照DB32/T1123-2007《江蘇省稻瘟病鑒定方法與抗性評價技術規程》劃分抗感類型和病級(表2)。

2 結果與分析

2.1 供試材料抗性基因分析

利用水稻稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54的功能標記對80份育種材料進行檢測(圖1，表3)，結果顯示：含有1個抗性基因的材料有12份，占總材料的15 %；含有2個抗性基因的材料有40份，占總材料的50 %；含有3個抗性基因的材料有21份，占總材料的26.25 %；含有4個抗性基因的材料有1份，占總材料的1.25 %；4個抗性基因均沒有的材料有6份，占總材料的7.5 %。

表1 PCR引物名稱、序列及片段大小Table 1 Name, sequences and fragment size of specific primers used for PCR

表2 水稻品種穗頸瘟調查抗性分級和抗性評價標準Table 2 Investigation and evaluation criteria of resistance of rice varieties to neck blast

2.2 水稻穗頸瘟抗性鑒定

采用人工接種的方法，進行水稻穗頸瘟抗性鑒定。在2016年穗頸瘟接種鑒定中，80份試驗材料中未發現0級免疫的材料，1級高抗的有38份，2級中抗的有21份，3級感病的有18份，4級高感的有3份。在2017年穗頸瘟接種鑒定中，80份試驗材料中未發現0級免疫的材料，1級高抗的有22份，2級中抗的有22份，3級感病的有20份，4級高感的有16份。從連續兩年的接種結果可以看出，抗病材料數量在逐漸減少，感病材料數量在逐漸增加。

圖1 標記Pi-ta、Npi-ta、Pi-b、Npi-b、Pigm和 Pi54在部分品種中的PCR擴增結果Fig.1 The result of PCR using functional marker of Pi-ta, Npi-ta, Pi-b, Npi-b, Pigm, and Pi54 in part varieties

表3 80份試驗材料穗頸瘟抗性鑒定與標記檢測Table 3 Identification of resistance for panicle blast and marker detection for 80 test materials

表4 不同抗性基因組合的抗病性Table 4 Rice blast resistances of different genes and gene combinations

2.3 抗性基因分布與抗性相關性分析

通過對供試材料中4個抗性基因分布與抗性相關性分析表明(表4)，80份試驗材料中，兩年穗頸瘟鑒定都表現為感病的有21份，檢測到的抗性基因不超過2個，其中含Pi-b基因的材料有10份，含Pi54基因的材料有13份，沒有檢測到4個抗性基因的材料有4份。第1年接種鑒定表現為抗病，但第2年表現為感病的材料，總共有15份，除有3份材料沒有檢測到Pi-ta基因外，其余都檢測到Pi-ta基因，表明2017年Pi-ta基因對稻瘟病抗性水平在下降。含3個抗性基因的材料有21份，其中兩年表現均為抗病的有17份，其余4份第1年表現為抗病，第2年表現為感病，基因型為Pi-ta+Pi-b+Pigm。含有4個抗性基因的材料有1份，兩年接種結果都表現為抗病。

3 討 論

與傳統的水稻抗病育種相比較，利用分子標記輔助選擇育種，具有快速、簡便、不受水稻生育期和環境影響的特點。范方軍等[19]利用水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi-km和Pi54的功能標記檢測64份水稻品系，結果表明，抗稻瘟病基因Pi-ta與穗頸瘟存在顯著相關性。戴小軍等[22]利用水稻抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi9和Pi-km的分子標記，對抗性基因與抗性反應相關性進行探討，結果表明，以Pi9為主效基因，同時聚合Pi-ta和Pi-b可以持久提高抗稻瘟病能力。王軍等[23]利用4個抗稻瘟病基因分子標記，檢測2007-2013年江蘇省審定的粳稻品種，結果顯示稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pi-km與穗頸瘟的抗性呈正相關。向小嬌等[24]研究發現水稻導入基因pi21，存在對產量的負效應，單獨用來改良水稻品種的稻瘟病抗性，需要與抗性強的主基因聚合，通過多次回交和自交打破該基因與產量的不利連鎖累贅。因此，在對基因選擇聚合育種時，了解抗性材料的基因型背景，從而有針對性的進行多基因聚合[25-26]。并不是聚合基因越多越好，而是應該選擇抗性好，抗譜互補的基因進行聚合。多基因的聚合不僅抗譜拓寬，而且對一些生理小種的抗性也提高，因為多基因的聚合不是簡單地單個抗性基因的抗譜累加，而是抗性基因之間表現為極顯著的基因互作[27]。

本研究中主要利用幾個強致病稻瘟病小種，對80份資源材料進行連續兩年穗頸瘟抗性鑒定，且利用水稻稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pigm和Pi54的功能標記進行基因型分析，并分析不同基因型對穗頸瘟的抗性作用。在80份試驗材料中，2016年接種鑒定有21份材料表現為感病，其都沒有檢測到Pi-ta基因，2017年接種鑒定有36份材料表現為感病，其中有12份檢測到Pi-ta基因，說明2016年抗性基因Pita對江蘇省內稻瘟病菌優勢小種具有抗病性，2017抗性基因Pi-ta抗病能力在減弱。這是由于稻瘟病生理小種多、變化速度快、致病力差異大等原因，造成抗病材料在種植幾年后，抗性就會逐漸喪失。兩年接種鑒定都表現為高抗的材料有22份，其中基因型為Pi-ta+Pi54有5份，Pi-ta+Pi-b有5份，Pi-b+Pigm有1份，Pi-ta+Pigm有1份，Pi-ta+Pi-b+Pi54有3份，Pi-b+Pi54+Pigm有6份，Pi-ta+Pi54+Pigm有1份。結果表明，接種鑒定表現為高抗的材料，都是聚合2個及以上的抗病基因，且都含有主效抗病基因Pi-ta或Pigm。兩年接種鑒定都表現為感病的材料有21份，其中基因型為Pi54+Pigm有2份，Pi-b+Pigm有2份，Pi-b+Pi54有6份，Pi-b有2份，Pi54有5份，沒有檢測到4種抗病基因的有4份。含有單個抗病基因的Pi-b和Pi54在抗性鑒定中基本已經喪失抗性。因此，應該有針對性的選擇多基因進行聚合，僅僅聚合Pi54+Pigm、Pi-b+Pigm、Pi-b+Pi54仍表現為感病特征。雖然，單個抗病基因Pi-b和Pi54的抗性較弱，但基因型為Pi-ta+Pi-b+Pi54和Pi-b+Pi54+Pigm，兩年接種抗性中都表現為抗病，一方面，稻瘟病抗性是由多個基因控制，其中主效基因對稻瘟病的抗性影響最大；另一方面，稻瘟病菌生理小種很多，不同抗性基因對生理小種的抗性存在差異。因此，在多基因聚合中，選擇以Pi-ta或Pigm為主效基因，同時聚合Pi-b和Pi54基因，抗譜能夠互補，可以提高抗稻瘟病的持久性。

4 結 論

從上述研究結果來看，針對復雜多變的稻瘟病菌種群結構，利用單一的抗性基因進行水稻抗病育種很難具有持久抗性，因此，在以后的水稻抗病育種中，需要引進不同的抗性資源，同時挖掘新的抗稻瘟病基因并進行多個有效抗病基因的聚合，才可能選育出具有廣譜持久抗性的水稻新品種。