易感線蟲番茄品種Rutgers遺傳轉化體系的建立

吳文濤，董 瑩，鄧人可，薛美靜，張 靖，王 揚

(云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201)

【研究意義】番茄(Solanumlycopersicon)又稱為西紅柿、番柿，屬茄科(Solanaceae)，起源于熱帶和亞熱帶地區的經濟作物。其營養豐富，味道獨特，逐漸成為主要的蔬菜作物被世界各國廣泛種植。另外，番茄作為一種重要的模式經濟作物，與其他模式作物相比，除了具有基因組較小、遺傳學基礎雄厚等特點外，還具有獨特的生物學現象(果實的發育、成熟過程等)[1-2]。因此，對番茄的遺傳轉化進行研究具有極其重要的意義。 根結線蟲(Meloidogynespp.)是世界上分布最廣、危害最重的植物寄生線蟲，已引起廣泛的關注，也是中國最主要的農作物病原線蟲[3-5]。【前人研究進展】1932年中國首次報道了南方地區番茄發生根結線蟲病，隨后全國范圍內10余個省(區)都有根結線蟲病的爆發和危害，其蔓延迅速并逐年加重，一般每年造成10 %～15 %的經濟損失，嚴重的達30 %～40 %，甚至絕產[6-7]。【本研究切入點】番茄是中國廣泛種植的蔬菜作物，但大多數番茄品種對根結線蟲均缺乏抗性。因此通過選育抗性品種加強對番茄根結線蟲病的防控具有重要的現實意義[8]。Rutgers是國際上公認的易感線蟲病的番茄品種，也被作為線蟲抗感性評定的標準品種[9]。【擬解決的關鍵問題】因此選擇Rutgers作為受體材料，建立其遺傳轉化體系，為番茄的抗根結線蟲轉基因育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以感病番茄品種Rutgers為實驗材料。

1.2 載體、工程菌株和遺傳轉化方法

所用植物表達載體質粒為pCAMBIA1304，質粒上帶有植物抗性篩選標記潮霉素磷酸轉移酶基因Hyg;農桿菌菌株為EHA105;采用葉盤法作為遺傳轉化方法[10]。

1.3 培養基

1.3.1 種子萌發培養基 種子萌發培養基：1/2MS培養基+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH值5.8。

1.3.2 誘導愈傷培養基 誘導愈傷培養基：MS培養基+ZT 2 mg/L + IAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH 5.8。其中IAA和ZT要在滅菌后添加。

1.3.3 共培養基 愈傷組織與農桿菌共培養的培養基：MS培養基+蔗糖20 g/L+葡萄糖10 g/L+瓊脂8 g/L+乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)100 μmol/L 。

1.3.4 篩選培養基 愈傷組織與農桿菌共培養后，篩選農桿菌侵染成功的愈傷組織采用的培養基：MS+ ZT 2 mg/L+IAA 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+Cef 600 mg/L,分別加入 Hyg的濃度為10、20、30、50 mg/L。

1.3.5 芽誘導培養基 愈傷組織誘導再生芽的培養基：MS培養基+蔗糖 30 g/L+瓊脂 8 g/L+6-BA+IAA，pH5。設計6-BA的濃度為 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，IAA的濃度為0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L，兩者相互組合。滅菌后在培養基中加入Cef (200 mg/L) 和 Kana(50 mg/L)。

1.3.6 生根培養基 生根的培養基：1/2MS培養基+瓊脂8 g/L+Kana 50 mg/L+IBA,設計IBA的濃度分別為 0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L。上述各種培養基所用到的激素和抗生素均在滅菌后添加。

1.4 遺傳轉化方法

1.4.1 無菌苗的獲得 將Rutgers番茄種子先用75 %的乙醇搖晃30 S，無菌水沖洗3～4次；用5 %的NaCIO溶液搖晃20 min至種子變白，再用無菌水沖洗5～6次后將番茄種子放于滅過菌的干燥濾紙上晾干，將晾干的番茄種子置于1/2MS培養基上，在26 ℃光照下萌發種子。

1.4.2 最佳苗齡測定實驗 將5、7、9和11 d的無菌苗的子葉切下，接種于MS+ ZT 2 mg/L+ IAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L的誘導愈傷組織培養基中，培養20 d左右，觀察所選不同苗齡愈傷組織的生長情況，從而確定出最適合組織培養的番茄的苗齡[11]。

1.4.3 愈傷組織的培養 取9～11 d苗齡的番茄幼葉，將子葉切下，然后子葉頂端切去 1 mm，將剩余部分橫切一刀分為2塊大小相同的子葉塊，子葉葉片均勻放在誘導愈傷培養基上，最后放到光照培養間25 ℃光照培養。

1.4.4 農桿菌懸浮液的準備 從平板上挑取含有pCAMBIA1304載體的單菌落，接種于5 mL YM液體培養基(加入Rif 20 mg/L和Kana 50 mg/L)中，28 ℃，180 r/min過夜培養。次日按照1∶50的比例接種到新鮮的YM液體培養基當中，28 ℃，180 r/min培養5～6 h至OD600值為0.6～0.8。將培養液5000 r/min，4 ℃離心12 min，去上清后加入重懸液，重懸至OD值達到0.3左右，最后加入100 μmol/L濃度的AS(乙酰丁香酮)混勻備用。重懸液為液體培養基，是在MS基礎培養基中附加20 g/L D-葡萄糖和10 g/L蔗糖，117 ℃高溫滅菌20 min(因含有葡萄糖，滅菌溫度太高葡萄糖容易碳化)。

1.4.5 愈傷組織的侵染和共培養 將用來做轉化的愈傷組織放到無菌三角瓶里，倒入適量重懸后加了AS的菌液，能沒過材料高3 mm左右即可，放到搖床中100 r/min，20 ℃搖晃30 min。30 min后，在超凈臺中把材料倒在滅過菌、鋪了濾紙的玻璃培養皿中晾干，然后將浸染好的愈傷組織放在鋪放無菌濾紙的共培養基上，18 ℃ 暗培養 2 d。

1.4.6 侵染后愈傷組織的篩選 將共培養之后的愈傷組織接種到含有不同濃度Hyg的篩選培養基中，然后放在光照培養箱中培養。約15 d左右更換1次篩選培養基，共更換2次培養基，觀察愈傷組織的成活率。

1.4.7 番茄再生芽誘導篩選 將篩選得到的長出芽點的愈傷組織轉移到含有不同濃度的細胞分裂素(6-BA)和生長素(IAA)的芽誘導篩選培養基上，在25 ℃光照條件下培養，約2周左右繼代1次，觀察出芽情況。

不定芽的誘導率(%) = (分化不定芽的外植體數/接種外植體數) ×100[12]

1.4.8 轉基因番茄苗的生根和移栽 先將篩選得到的番茄芽放入芽誘導培養基中生長至2 cm左右后，再放入含有不同濃度IBA的生根培養基中，在25 ℃光照下培養，觀察番茄苗的生根情況。當轉基因番茄苗生根以后，洗去根部培養基后移栽到土中。

1.4.9 目的基因的PCR檢測 取長勢良好的番茄植株，采用CTAB法[13]提取轉基因番茄植株與普通植株的DNA，使用潮霉素抗性基因Hyg的特異性引物進行PCR特異性檢測，Hyg上下游特異性引物為hyg(+):ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC, hyg(-):GGAAGTGCTTGACATTGGGGA。

2 結果與分析

2.1 不同苗齡對番茄愈傷組織誘導的影響

選取苗齡5、7、9和11 d番茄的子葉接種于誘導愈傷培養基中，苗齡5 d的番茄子葉接種7 d 后有 60 %子葉邊緣發黑，另外40 %的子葉明顯膨大，但并沒有愈傷組織生成(圖1A)；苗齡7 d的番茄子葉接種 7 d 后有70 %子葉明顯膨大，20 d后有少數膨大子葉分化出愈傷組織(圖1B)。苗齡9和11 d的番茄子葉在接種7 d后有90 %子葉明顯膨大，外植體顏色加深; 接種15 d后子葉切口處均產生大量愈傷組織，培養20 d左右，在愈傷組織上可見淺黃色的小突起，即為潛在的芽點(圖1C、D)。所以應選取苗齡9～11 d的子葉作為最適宜的外植體。

2.2 不同濃度的Hyg對農桿菌侵染后愈傷組織分化的影響

將與農桿菌共侵染后的愈傷組織放入含有不同濃度Hyg的篩選培養基中可以發現，在含有10 mg/L Hyg的篩選培養基上愈傷組織的存活率最高，開始有芽點生成(圖2A)；在20 mg/L Hyg的篩選培養基上愈傷組織基本不能存活(圖2B)；Hyg的濃度越高，番茄愈傷組織的存活率越低，當Hyg濃度達到50 mg/L(圖2D)。時，番茄愈傷組織幾乎全部褐變死亡。因此，Hyg的濃度大約在10 mg/L時可以有效的篩選轉基因的抗性芽。

2.3 不同激素濃度配比對愈傷組織誘導不定芽的影響

含有不同濃度的6-BA和IAA的再生芽誘導培養基對愈傷組織的芽誘導率差異明顯(表1)。6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.1 mg/L處理番茄愈傷組織芽誘導率最高為55 %，6-BA 1.0 mg/L+ IAA 0.05 mg/L處理番茄愈傷組織芽誘導率最低為10 %。因此6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.1 mg/L為最理想的芽誘導培養基。

A：苗齡5 d番茄誘導的愈傷組織；B：苗齡7 d番茄誘導的愈傷組織；C：苗齡9 d番茄誘導的愈傷組織；D：苗齡11 d番茄誘導的愈傷組織A:5 days tomato seedling-induced callus; B:7 days tomato seedling-induced callus; C:9 days tomato seedling-induced callus; D:11 days tomato seedling-induced callus圖1 不同苗齡子葉誘導愈傷的發育情況Fig.1 Development of cotyledon-induced callus in different seedling ages

A：Hyg濃度為10 mg/L的篩選培養基；B：Hyg濃度為20 mg/L的篩選培養基；C：Hyg濃度為30 mg/L的篩選培養基；D：Hyg濃度為50 mg/L的篩選培養基A:Screening medium with a Hyg concentration of 10 mg/L; B:Screening medium with a Hyg concentration of 20 mg/L; C:Screening medium with a Hyg concentration of 30 mg/L; D:Screening medium with a Hyg concentration of 50 mg/L圖2 不同濃度Hyg下愈傷組織的篩選Fig.2 Screening of callus under different concentrations of Hyg

表1 不同濃度的6-BA和IAA的組合對番茄愈傷組織的芽誘導的影響Table 1 Effect of different concentrations of 6-BA and IAA on shoot induction of tomato callus

2.4 不同濃度IBA對番茄不定芽生根的影響

對轉基因番茄不定芽進行生根誘導時發現，在生根培養基中添加0.1 mg/L IBA時，轉基因番茄苗的生根率最高、生根時間最短，根生長狀況最好。

2.5 轉基因植株的獲得

將生根的T0植株直接移入腐殖土中，在溫室自然光照下生長,最終獲得轉基因抗性苗。圖3顯示了番茄遺傳轉化過程中的分化、生根和移栽的全過程。

2.6 目的基因的PCR分子檢測

為了證明Hyg基因已經被整合到番茄基因組當中，對T0代轉基因番茄做PCR檢測，檢測結果如圖4，選取的3個轉基因植株均擴增出280 bp的Hyg基因片段，而對照組的普通植株沒有檢測到Hyg基因，說明采取的試驗方法可以獲得Rutgers番茄品種的轉基因植株。

3 討 論

針對不同苗齡對番茄愈傷組織誘導影響，研究表明，Rutgers番茄品種苗齡9～11 d的葉片更容易分化出愈傷組織，分化率高于90 %。而苗齡低的葉片分化率極低，究其原因是苗齡較低的葉片修復能力較差，對其切割后影響其生理代謝功能和細胞的全能性發揮。而苗齡9～11 d的葉片自身的修復能力較強，生理代謝更為活躍，切割后更容易分化出愈傷組織、并成芽[14]。因此愈傷組織分化時應選擇合適苗齡的無菌苗。

表2 不同濃度IBA對番茄不定芽生根的影響Table 2 Effects of IBA on root induction of processing tomato

A：無菌苗的培養階段；B：子葉在誘導愈傷培養基上誘導分化愈傷組織階段；C：農桿菌侵染番茄后的共培養階段；D：愈傷組織在篩選培養基誘導不定芽階段；E：生根培養基生根階段；F：轉基因苗生長階段A: The culture stage of the sterile seedling; B: The cotyledon inducing the differentiation callus stage on the induced callus medium; C: The co-cultivation stage after the Agrobacterium infects the tomato; D:Induction of adventitious bud stage of the callus in the screening medium; E: Rooting stage of rooting medium; F: Stage of growth of transgenic seedlings圖3 Rutgers番茄遺傳轉化的不同生長階段Fig.3 Different development stages of transgenic Rutgers

M：DNA標樣； 1：普通番茄植株； 2～4：轉基因番茄植株M: DNA standard; 1: Common tomato plants; 2-4: Transgenic tomato plants圖4 轉基因植株的PCR檢測Fig.4 PCR detection of transgenic plants

細胞分裂素和生長素的濃度配比決定了番茄遺傳轉化體系中愈傷組織的出愈率、不定芽的誘導率和不定芽生根等各個環節。以番茄Rutgers為材料，不定芽誘導的最佳激素濃度配比為6-BA 2 mg/L+IAA 0.1 mg/L，與Carolina Cortina 等[15]研究在優化番茄M82的再生體系時發現不定芽誘導的最佳激素濃度配比為ZT 0.5 mg/L+ IAA 0.5v、張麗華等[16]研究加工番茄BO2和BO4的誘導芽培養基的最佳激素濃度配比為ZT 1.0 mg/L+ IAA 0.05 mg/L存在差異，究其原因與番茄的品種和基因型存在很大關聯[17-20]。因此針對不同品種的番茄建立遺傳轉化體系，探索其誘導芽培養基的激素配比是尤為重要的方向。

不同番茄品種所用的生根培養基也大有不同，羅素蘭等[21]在研究T79和T151番茄再生體系過程中認為最佳的生根培養基為MS+IAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L，何秀霞等[22]得到的生根培養基為1/2MS+蔗糖3 %+瓊脂0.7 %+IBA 1.0 mg/L，而番茄Rutgers的生根培養基為1/2MS基本培養基+8 g/L瓊脂+0.1 mg/L。

4 結 論

目前報道有許多番茄的遺傳轉化方法和體系，如陳雙臣等[23]建立了Micro-Tom番茄的遺傳轉化體系、喬亞紅等[24]建立了加工番茄紅番3號的遺傳轉化體系。但未見有關Rutgers易感線蟲番茄品種遺傳轉化體系的報道，而利用轉基因抗病品種解決番茄根結線蟲病又是近年來最受關注的育種策略。因此以番茄Rutgers為研究材料，首次建立其遺傳轉化體系為后續番茄的抗根結線蟲轉基因育種奠定基礎。