泌尿生殖道脲原體喹諾酮類耐藥機制的初步研究

程燦燦，朱劍霞，古裕蓮，陳順儀，張金枚

(1.廣州市番禺區中心醫院檢驗科，廣州 511400； 2.江門市中心醫院中山大學附屬江門醫院產科，廣東 江門 529000)

引起泌尿生殖道感染的常見支原體有脲原體、人型支原體以及生殖支原體。脲原體屬有Parvo和T960兩個生物型，其是兩個獨立的種。具有Parvo生物群特征的脲原體又被稱為微小脲原體(Ureaplasma parvum，Up)，而有T960生物群特征的支原體被稱為解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum，Uu)[1]。在臨床工作中，常規支原體培養及藥敏檢測尚不能區分Uu和Up[2]，本研究收集的脲原體包括這兩個種。由于脲原體結構和代謝上的特殊性，導致用于臨床治療的抗菌藥物有限，目前主要有喹諾酮類、大環內酯類和四環素類藥物。近年來支原體的耐藥呈現逐年升高的趨勢，其對喹類藥物的敏感性顯著降低，耐藥現象尤為嚴重[3]。研究顯示，喹諾酮耐藥決定區域(quinolone resistance determining regions，QRDRs)基因突變與脲原體對該類藥物的耐藥相關[4]。本研究針對性地檢測脲原體gyrA、gyrB、parC、parE基因中QRDRs的突變情況，初步探討泌尿生殖道脲原體對喹諾酮類的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1菌株來源 選擇2017年2月在廣州市番禺區中心醫院就診的556例泌尿生殖道感染患者為樣本來源，患者年齡16～64歲，平均(33±8)歲，無其他嚴重基礎疾病。由接診醫師進行標本采集。男性清洗及消毒尿道口后，用尿道拭子插入患者尿道口2～4 cm處輕旋1周，停留片刻后取出；女性清洗及消毒外陰后，用拭子插入患者宮頸口1～2 cm處輕旋1周，停留片刻后取出。標本無菌密封并立即送檢。

1.1.2主要儀器和試劑 Veriti FAST 96-WELL型聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(美國Applied Biosystems公司)；Gel Doc XR+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；Taq DNA聚合酶(批號：AH0645A)、DNA Marker 2000(批號：A2201C)均購自TaKaRa公司[日本寶生物工程(大連)有限公司]；DNA提取液購自中山大學達安基因股份有限公司(批號：2017001)；支原體培養、鑒定、藥物敏感一體化試劑盒購自珠海麗珠生物技術有限公司(批號：2016119809)；引物合成及測序服務均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1支原體培養及藥敏試驗 嚴格按照支原體培養、鑒定、藥物敏感一體化試劑盒說明書進行標本的接種、鑒定及藥物敏感結果判定。具體操作為：溶解培養小瓶中的培養基后，取50 μL培養基加入C-空白孔中，然后將無菌拭子采集的樣本插入培養基中，擠壓旋轉拭子數次，棄拭子，將混勻的液體培養基分別加入試劑條所有鑒定及藥敏孔中(除C-外)。最后在每一孔中滴加一滴無菌液體石蠟并密封。將含有剩余培養基的培養小瓶與試劑條一起置于35 ℃的培養箱中培養，分別于24、48 h后觀察鑒定及藥敏結果。其中，試劑條喹諾酮類藥物的藥敏孔為氧氟沙星(4 mg/L和8 mg/L)、左氧氟沙星(2 mg/L和8 mg/L)和司帕沙星(1 mg/L 和4 mg/L)，3種藥物分別設置高、低兩個濃度，每個濃度設置1孔。在檢驗結果鑒定為脲原體陽性的標本中，對應藥物的兩個濃度藥敏孔均不變色提示對該藥物敏感，對應藥物的兩個濃度藥敏孔均變為紅色提示對藥物高度耐藥，低濃度孔變紅色、高濃度孔不變色提示低度耐藥。從中篩選出對喹諾類藥物低度耐藥和高度耐藥的脲原體陽性的培養基(菌液)，并于-80 ℃保存備用。

1.2.2脲原體DNA提取 選取7株有代表性的菌株(對至少1種喹諾酮類藥物高度耐藥)提取DNA并進行基因擴增和測序。取上述保存備用的菌株液體培養物400 μL，12 879×g離心5 min后棄上清，加滅菌的0.9%氯化鈉溶液1 mL,充分混勻后12 879×g離心5 min并棄上清液；沉淀物中加入50 μL DNA提取液，充分混勻后100 ℃溫浴10 min，冷卻后12 879×g離心5 min，取上清液備用。

1.2.3PCR擴增及測序 以提取的脲原體DNA為模板，PCR擴增gyrA、gyrB、parC、parE基因。所涉及的引物序列[5]見表1。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，退火30 s(各片段退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，并將擴增出的PCR產物送公司進行純化測序。

表1 引物列表

1.3觀察指標 根據鑒定及藥敏結果分析脲原體感染和耐藥情況。對測序基因進行序列分析，參照已報道的脲原體標準株Up ATCC 27815(GenBank序列號：CP000942)[6]和Uu ATCC 33699(GenBank序列號：CP001184)[7]的gyrA、gyrB、parC、parE基因分析并確定耐藥菌株的QRDRs序列的突變情況，并進行氨基酸預測。

2 結 果

2.1引起泌尿生殖道感染的支原體菌株分布及藥敏結果 本研究共有556份標本送檢，其中支原體陽性標本314例，單純脲原體感染246例。支原體陽性率達44.2%(246/556)。菌株藥敏試驗顯示，43例對3種喹諾酮類藥物均敏感，占17.5%；38例對至少1種藥物高度耐藥，占15.4%。對氧氟沙星高度耐藥的菌株有36例，占14.6%，對司帕沙星敏感的菌株有88例，占35.8%，見表2。

表2 246例單純脲原體感染病例對喹諾酮類藥物的耐藥情況

2.27株菌株的PCR擴增結果及分析 PCR擴增7株菌株的gyrA、gyrB、parC、parE基因片段，經電泳檢測在250～500 bp有一明亮清晰條帶，與目標片段大小一致，見圖1。

M：marker 2000；1-7泳道分別為1-7號標本對應的PCR擴增產物

圖1 gyrA、gyrB、parC、parE基因片段電泳圖

PCR產物經純化測序，得到的DNA序列與標準菌株(ATCC 27815)相應的基因序列進行比較。結果顯示，7株菌株的gyrA和gyrB片段與Up ATCC 27815的相應基因序列相似度為100%，而與Uu ATCC 33699的相應基因序列相似度則較低，7株菌株可能均為Up而非Uu。耐藥菌株的parC和parE片段與ATCC 27815的相應基因序列比較，7株耐藥菌株的parC均可見C248T突變，parE均可見T1473C突變。見表3。在這些突變點中，只有C248T為非同義突變，造成parC的第83位氨基酸由絲氨酸變為亮氨酸(S83L)，其余突變位點均為同義突變，未導致氨基酸改變。

3 討 論

因脲原體無細胞壁，所以對作用于微生物細胞壁的抗菌藥物如β-內酰胺類、萬古霉素等天然抵抗；又由于其生長繁殖過程不合成葉酸，因此對磺胺類及甲氧芐啶也不敏感；此外，對氨基糖苷類、多黏菌素、利福平等也高度耐藥。泌尿生殖道支原體感染

表3 7株耐藥菌株parC和parE基因的變異情況

治療首選大環內酯類、喹諾酮類以及四環素類藥物。喹諾酮類是一類人工合成的廣譜抗生素，對脲原體有較好的抗菌活性，可口服用藥，因不良反應少而被廣泛應用。本地區之前的研究顯示，脲原體對喹諾酮類藥物(氧氟沙星、左氧氟沙星和司帕沙星)的全敏感率為12.24%[8]，本研究結果(17.5%)與此接近。脲原體對喹諾酮藥物不同程度的耐藥在本地區及其他地區已相當嚴重，因此探討耐藥機制十分必要。

喹諾酮類藥物是通過抑制Ⅱ型拓撲異構酶活性(包括旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ)，阻止細菌DNA復制，從而導致細菌不能正常繁殖傳代。旋轉酶是由gyrA和gyrB基因編碼，而拓撲異構酶Ⅳ是由parC和parE編碼。這4個基因的突變均可導致酶結構或空間構象的改變，進而導致藥物不能與靶酶結合而產生耐藥。本研究選取的是對至少1種喹諾酮類藥物高度耐藥的菌株。這7株菌的旋轉酶基因gyrA、garB的保守性較高，在所測序列位置未發現堿基突變。拓撲異構酶Ⅳ基因的突變較多。與標準菌株ATCC 27815序列進行比較，parC基因C248T(S83L)突變模式在7株菌中均存在。有文獻報道，C248T是否發生與喹諾酮類藥物敏感性密切相關[9-10]。近年來，這一突變在臨床分離的耐喹諾酮的Up與Uu中被頻繁檢出，成為中國地區QRDRs最普遍的突變[7]。S83L在parC上的突變在全球各地頻繁出現，歐洲[11]、北美[4]、亞洲等地都有報道。Kawai等[10]采用軟件對S83L和S83W進行結構預測分析發現，這兩個突變的氨基酸位點均可通過位阻作用干擾菌株與喹諾酮類藥物的結合，但在體外實驗中并未觀察到該突變直接導致脲原體耐藥的證據。S83L和S83W形成的耐藥性可針對氧氟沙星、左氧氟沙星和司帕沙星3種喹諾酮類藥物。雖然該突變與喹諾酮類藥物的耐藥機制相關，但這7株帶有相同耐藥突變位點的菌株對這3種喹諾酮類藥物的敏感性不完全相同，提示極有可能存在其他的耐藥機制。有報道指出，脲原體細胞膜通透性的改變可能是耐氟喹諾酮類機制其中之一[12]。

本研究結果顯示，parC、parE基因存在較多的同義突變位點。parC基因的突變G270C、T408C和parE基因的突變T1473C在本研究中也較普遍，但未發生氨基酸突變，可能是基因的多態性位點。對于gyrA基因，最常見的非同義突變是L176F，其次是Up中的 F67I、K78I、G179D、S174R，以及Uu中的 D77V[3]。研究顯示，與喹諾酮相關的parC和gyrA突變類型可能存在地區差異[13]。因此，有必要進行大樣本耐藥基因的調查分析，了解本地區脲原體QRDRs突變特點，以明確本地區脲原體對喹諾酮類藥物的耐藥機制。

7株臨床株經擴增后測序發現，gyrA、gyrB、parC和parE基因與標準菌株的序列比較，提示屬于Up的可能較大。目前，Uu和Up的劃分主要依據基因組之間的差異，核酸檢測能進行區分[14]，但尚未應用于臨床診斷。文獻報道，Up的檢出率明顯高于Uu，甚至健康體檢人群也攜帶Up[15]，但截至目前尚不能證明哪一種脲原體的致病性更強。在女性下生殖道標本中脲原體的定植較常見，因此臨床工作中Uu及Up的區分也十分必要。但在對喹諾酮藥物如氧氟沙星、左氧氟沙星的體外敏感性上，Uu及Up的差異并不大[16-17]，parC基因的C248T突變造成的氨基酸S83L改變在兩種脲原體中均有檢出，并未發現在哪一種脲原體中獨立存在。許多研究致力于脲原體耐藥機制的探索，但其耐藥機制復雜，目前尚無確定的單一耐藥機制。目前認為主要是gyrA、gyrB、parC以及parE基因的突變導致脲原體對氟喹諾酮類藥物不敏感[18]，但有報道顯示形成生物被膜與喹諾酮類藥物敏感性降低有關[19-20]。有專家研究了基于脲原體管家基因(ftsH、rpL22、valS、thrS)的多位點序列分型方案，試圖通過研究脲原體的不同克隆群特點分析多位點序列分析與脲原體藥物敏感性的關系[21]。

綜上所述，喹諾酮類藥物對本地區的脲原體存在較低的體外敏感性，并檢測到脲原體存在與喹諾酮耐藥相關的基因突變，即parC基因C248T(S83L)突變。由于本研究的限制及現有的耐藥機制研究并不能完全解釋脲原體臨床分離株對喹諾酮的耐藥機制，因此持續監測解脲脲原體喹諾酮類藥物的耐藥情況并進一步探討脲原體喹諾酮耐藥機制十分必要。