DISS對卒中后抑郁大鼠神經遞質的作用

葉夢瑤 鄒文靜 茅瑛琦 陳煜陽 潘曉蕓 裘濤

腦卒中是重大公共衛生問題［1］。卒中后抑郁（Poststroke depression，PSD）作為最常見的卒中相關情緒障礙［2］，其發病率在第1 年約為20%～50%，在卒中后的前6 個月達到高峰［3］，卒中后＜5 年可能影響1/3 的患者［4］。PSD 危險因素包括年齡、性別、抑郁病史、認知障礙、個性、卒中及殘疾的嚴重程度、卒中的位置、社會支持等［5］，其可能機制包括神經遞質假說、免疫失衡假說，涉及神經解剖學、神經遺傳學和社會心理學［6］。3，6’-二芥子酰基蔗糖（DISS）是遠志的主要活性成分之一，具有抗抑郁［7］、腦保護［8］和神經細胞保護作用［9］。2016 年6 月至2017 年10 月作者通過實驗研究，探討DISS 對腦卒中后抑郁大鼠神經遞質的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD 大鼠50 只（220～270g），清潔級，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，批號：SCXK（滬）2012-0002。實驗于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心進行，以5 只/籠群養標準安放大鼠，更換墊料1 次/2d，保持籠內環境清潔，保持晝夜更替，給予正常飲食，飼養2 周，予抓取1次/2d，使其適應動物房環境以及實驗操作人員。

1.2 建立大鼠腦缺血模型 在改良Zea-Longa 線栓法［16］基礎上通過大腦中動脈栓塞（MACO）法建立大鼠腦卒中模型。4h 后，利用Bederson 法評價大鼠神經功能受損情況。手術后神經功能評分為1、2、3 分的大鼠納入后續實驗，評分為0 分、4 分不納入。MCAO造模后大鼠適應性飼養3d，將病情穩定的大鼠納入后期制備實驗卒中后抑郁大鼠，納入總數為30 只。

1.3 制備PSD 大鼠模型與分組 經過卒中模型制備術后入組的大鼠進行每天單籠孤養及2h 束縛。束縛以大鼠不能轉側為標準，束縛時間從13 ∶00 至15 ∶00，連續21d。隨機分為PSD+生理鹽水（NS）組，PSD+氟西汀（Flx）組，PSD+DISS 組，以及正常組（CC 組），每組各10 只。

1.4 試劑準備及給藥 DISS 純度99.06%（HPLC）（成都曼斯特生物科技有限公司研制，批號：MUST-16070608）。鹽酸氟西汀分散片（20mg×28 片/盒，批號：160622，廠家：PATHEON FRANCE）。10%水合氯醛（杭州昊天生物科技有限公司），9%生理鹽水（杭州民生藥業有限公司），給藥周期為21d，從束縛第1天開始，束縛前30min，PSD+DISS 組予DISS 稀釋液，給藥量為4.7g/（kg·d）（按人體用藥量換算成大鼠等效劑量），PSD+FLX 組予氟西汀藥液灌服1 次，用量為1.8mg/（kg·d），正常組和PSD+NS 組則灌服等量生理鹽水6.7ml/（kg·d）。

1.5 行為學實驗 （1）體質量監測：稱量各組大鼠在制備PSD 模型前、孤養束縛第7、14、21 天的體質量，并記錄。（2）糖水偏好實驗：于孤養束縛后第7、14、21 天進行糖水偏好試驗，在第6 天對大鼠進行糖水適應飲用訓練，即將2 瓶均為1%糖水在第1 個24h 內置于每個鼠籠，隨后在第2 個24h 內將1 個水瓶換為純凈水，另1 個瓶仍為1%糖水；大鼠禁食禁水21h后開始實驗，1 瓶1%糖水和1 瓶純凈水分別放置在每個測試鼠籠前，1h 后互換2 個水瓶位置，再過1h 后取瓶，測量并計算動物的糖水偏好程度。糖水偏好程度=糖水消耗量/總液體消耗量。

1.6 神經遞質水平測定 具體操作方法按試劑盒使用說明書操作。該試劑盒采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）水平。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組間多重比較行LSD 檢驗。大鼠建模前體質量采用單因素方差分析，建模后體質量變化及糖水偏好程度用重復測量方差分析；對單胺遞質分析采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量比較 PSD 模型建立前各組實驗大鼠體質量組間差異無統計學意義（P＞0.05）；各組大鼠4 個時間點體質量重復測量方差分析顯示，組間 效 應F=31.066，P＜0.001；時 間 效 應F=75.465，P＜0.001；時間組別交互效應F=13.881，P＜0.001。各組大鼠體質量隨時間變化上升，組間差異有統計學意義，時間和組間存在交互效應。各組大鼠4 個時間點體質量兩兩分析顯示：CC 組體質量大于其余各組；PSD+NS 組體質量小于其余各組；PSD+DISS組體質量小于PSD+FLX 組，差異均有統計學意義。見表1。

表1 各組大鼠體質量改變比較（±s）

表1 各組大鼠體質量改變比較（±s）

注：F組間=31.066，P＜0.001；F時間=75.465，P＜0.001；F交互=13.881，P＜0.001

組別 建模前 束縛第7天 束縛第14天 束縛第21天PSD+DISS組 245.00±5.77 256.25±27.80 236.75±30.30 259.00±30.13 PSD+FLX組 253.83±8.40 248.50±11.59 267.67±11.67 296.67±14.69 PSD+NS組 243.00±16.99 223.75±17.39 226.50±22.93 239.00±17.17 CC組 247.83±5.12 270.17±9.32 345.33±10.89 375.83±11.60

2.2 各組大鼠糖水偏好程度比較 各組大鼠3 個時間點糖水偏好程度重復測量方差分析顯示，組間效應F=65.232，P＜0.001；時間效應F=1.580，P=0.220；時間組別交互效應F=3.409，P=0.004。各組大鼠3 個時間點糖水偏好兩兩分析顯示：CC 組糖水偏好高于PSD+FLX 組及PDS+NS 組，差異有統計學意義；PSD+NS組糖水偏好第14、21 天低于其余各組，差異有統計意義；PSD+DISS 組糖水偏好均高于其他組，差異有統計學意義。見表2。

表2 各組大鼠糖水偏好程度結果比較（±s）

表2 各組大鼠糖水偏好程度結果比較（±s）

注：F組間=65.232，P＜0.001；F時間=1.580，P=0.220；F交互=3.409，P=0.004

組別 束縛第7天 束縛第14天 束縛第21天PSD+FLX組 0.71±0.03 0.71±0.05 0.72±0.02 PSD+DISS組 0.97±0.03 0.96±0.03 0.97±0.01 PSD+NS組 0.72±0.02 0.69±0.07 0.58±0.07 CC組 0.85±0.07 0.78±0.09 0.83±0.03

2.3 各 組5-HT、DA、NE 水 平 比 較 在5-HT 和DA 水平測定中，與CC 組比較，除PSD+FLX 組外，其余PSD 組均較低（P＜0.05）；與PSD+NS 組比較，PSD+DISS、PSD+FLX 組5-HT 和DA 水平較高（P＜0.05）。在NE 水平上，PSD+FLX 組高于CC 組（P＜0.05），其余PSD 組均低于CC 組（P＜0.05），且NS 組最低；與NS 組比較，其余兩個PSD 組均較高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組5-HT、DA、NE水平比較（±s）

表3 各組5-HT、DA、NE水平比較（±s）

注:與CC組比較，▲P＜0.05；與PSD+NS組比較，*P＜0.05；與PSD+FLX組比較，#P＜0.05

分組 5-HT DA NE PSD+NS組 32.33±5.40▲ 444.15±71.25▲ 41.75±6.75▲PSD+FLX組 56.56±3.45* 867.80±59.36* 68.20±4.17▲*PSD+DISS組 39.02±2.02▲*# 629.59±57.22▲*# 51.77±4.09▲*#CC組 52.89±4.01 868.55±57.78 64.81±2.83

3 討論

PSD 是腦卒中最常見的并發癥之一，在我國腦卒中患者的發病率＞40%［10］，其臨床可表現為情緒低落、興趣喪失、思維遲緩等。PSD 患者病死率較單純腦卒中患者高3～4 倍，因此臨床將PSD 視為預防二次腦卒中的關鍵環節。PSD 的發病機制復雜，涉及神經生物學、神經解剖學、社會心理學、神經內分泌學等諸多因素。目前多項發病機制均涉及5-HT、NE、DA 等單胺遞質的變化，如生物學機制認為腦卒中患者腦部血流量的異常損傷額葉與邊緣系統，破壞額葉-紋狀體-蒼白球-丘腦皮質環路，造成5-HT 和NE 等神經遞質代謝異常，從而導致PSD 的發生。從單胺能遞質角度進一步研究發現，缺血性病變可能阻斷來自中腦和腦干的投射，致使5-HT、NE 和DA 下降，導致PSD的發生［11］。

本實驗中，以MACO 及孤養束縛進行造模。劉福友等通過此造模及行為學評價、單胺遞質的測定證實本實驗復合制備的腦卒中后抑郁大鼠模型思路可行，造模是成功的［12］。通過查閱文獻也發現，MACO 聯合孤養束縛是應用廣泛的造模方法，且造模確切、成功。

遠志被用于鎮靜、緩解精神不安和提高學習與記憶能力［13］，DISS 作為遠志的主要活性成分，在以往研究中發現，其在抗抑郁作用中起重要作用。施振國等［14］認為，DISS 的抗抑郁機制可能是通過神經元保護和神經元再生實現的。趙潤清［15］認為DISS 參與啟動CREB 共轉錄因子CRTC1，激活海馬內CREB 的磷酸化，進而增加其下游BDNF 表達，發揮抗抑郁作用。陳旭［16］認為DISS 可以激活CREB 磷酸化的上游通路和鈣調蛋白激酶上的關鍵靶點CaMK 和 ERK，促進CREB 磷酸化過程，并進一步通過激活磷酸化CREB，與基因轉錄啟動區的特殊組件結合刺激mRNA 的轉錄，調節下游靶基因bax、bcl-2 并調節氧化應激等細胞因子的水平，通過這些細胞因子進一步影響神經可塑性神經分化、神經營養及神經聯系及信號整合發揮抗抑郁作用。

本資料結果顯示，模型組PSD+NS 組大鼠較CC組大鼠體質量減輕、糖水偏好程度下降，單胺遞質濃度降低，提示模擬出PSD 患者體質量下降、興趣感減退和腦內單胺類遞質降低等表現，表明造模成功。治療組單胺遞質水平結果均優于PSD+NS 組，表明FLX及DISS 的治療在一定程度上是有效的。PSD+DISS 組明顯優于PSD+FLX 組，且在實驗全過程均保持較高水平；但在體質量及單胺遞質水平方面，雖然PSD+DISS組優于PSD+NS 組，但仍低于PSD+FLX 組，差異有統計學意義。

綜上所述，DISS 對PSD 的改善可能通過提高5-HT、DA、NA 濃度水平發揮作用，然而，本研究僅基于行為學實驗及單胺類遞質濃度水平的測定對DISS的作用進行初探，其上游機制仍未明確，后期可進一步對上游通路CaMK Ⅱ-Cx43 信號通路的可能性作進一步深入研究以揭示藥物作用靶點，為其臨床應用提供實驗依據。