基于RNA干擾技術分析MCM7在涎腺腺樣囊性癌中的作用

帥旌 宋藝蔚 朱欣 顧天憶 溫慶良

涎腺腺樣囊性癌（salivary gland adenoid cystic carcinoma，SACC）是常見的涎腺惡性腫瘤之一［1］。其易侵犯神經，可隨血液播散，早期浸潤性強。臨床上表現為容易復發，易向遠處轉移，常見是血行轉移，晚期轉移至肺、骨骼和肝臟，其中肺轉移率達40%［2］。然而目前SACC 轉移及復發機制的相關研究依舊匱乏，但有研究發現SACC 的增殖、侵襲及轉移與多種通路及分子有關［3-5］。微小染色體維持蛋白（minichromosome maintenanc，MCM）參與DNA 復制過程。MCM7 在G1期和S 期對細胞周期的調控作用，使其與細胞異常增殖及腫瘤形成等關系密切［6］。較多實驗表明，MCM 蛋白的高表達是腫瘤發生的早期事件。2019 年6 月至10月作者通過實驗研究，探討MCM7 在涎腺腺樣囊性癌中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 原位涎腺腺樣囊性癌細胞株SACC-83 及涎腺腺樣囊性癌肺轉移細胞株SACC-LM 由北京大學口腔醫學院口腔頜面外科研究室提供。胎牛血清購于四季青公司，SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購于Solarbio 公司，CCK8 細胞增殖和毒性試劑盒購于Beyotime 公司，Transwell 購于Corning 公司，Matrigel購 于BD 公 司，MCM7 Antibody、GAPDH Antibody 購自Proteintech 公司，HRP 標記的羊抗小鼠二抗購自碧云天公司。siRNA 定制于百奧邁科生物技術有限公司，三種序列的siRNA-MCM7 分別為，序列1（正義鏈：5'-GGAUUGUGAAGAUGAACAAdTdT-3'；反義鏈：5'-UUGUUCAUCUUCACAAUCCdTdT-3'），序列2（正義鏈：5'-GGAGAUGAAGAUGCAAGAAdTdT-3'；反義鏈：5'-UUCUUGCAUC-UUCAUCUCCdTdT-3'）， 序 列3（正義鏈：5'-GCAUUGAUGAGUUCGACAAdTdT-3'；反義鏈：5'-UUGUCGAACUCAUCAAUGCdTdT-3'）。

1.2 細胞培養 將SACC-83、SACC-LM 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，放置在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，換液1 次/d，當貼壁細胞生長融合度達到90%時，胰蛋白酶消化傳代，取處于對數生長期細胞進行實驗。

1.3 Western blot 檢 測SACC-83、SACC-LM 中MCM7蛋白表達 在PBL 溶液浸潤中刮取培養瓶中處于對數生長期的SACC-83、SACC-LM 細胞，離心，去上清液，添加細胞裂解液，輕敲EP 管混合后迅速置于冰中，混合1 次/10min，共5 次。4℃，離心，保留上清液，采用BCA 試劑盒進行蛋白濃度矯正，加入loading buffer，煮沸。采用SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒配膠，上樣，觀察溴酚藍至凝膠最下緣終止電泳。轉膜2h，封閉1h，TBST 洗滌3 次，一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌3 次，稀釋二抗室溫結合2h，再于TBST 中洗滌3 次。采用ECL 發光液對SACC-83、SACC-LM 中MCM7 和內參GAPDH 條帶進行曝光。實驗重復3 次。

1.4 實驗分組 將SACC-LM 細胞按照50%密度接種至6 孔板內，待細胞融合度至80%后，將細胞分為干擾組3 組、陰性對照組，每組3 孔。在干擾組中分別轉染三個序列的siRNA-MCM7，在對照組中轉染siRNA-Negative Control。置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，6h 后換液，培養48h 后進行后續實驗。

1.5 Western blot 檢測轉染后各組中MCM7 蛋白表達 選擇轉染效率較高的2 組干擾組（si-MCM7-1、si-MCM7-2）與對照組（NC）進行實驗。步驟同1.3。

1.6 細胞克隆實驗測定細胞增殖情況 取對數生長期SACC-LM 細胞，以每孔1000 個細胞接種于6 孔板中，接種時多次吹打，接種后輕微晃動以均勻分散細胞。置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，96h 后對3組細胞集落計數。實驗重復3 次。

1.7 CCK-8 法測定細胞增殖情況 取生長良好的對數期SACC-LM 細胞，以每孔3000 個細胞配置100μl 懸液，接種于96 孔板中，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。將干擾1、2 組、NC 組各設置5 個復孔，于0、24、48、72h 分別將10μl CCK8 溶液在避光環境下加入各孔，用錫紙包裹繼續培養3h。以NC 組為對照組，酶標儀測量490nm 處OD 值。實驗重復3 次。

1.8 Transwell 小室檢測細胞侵襲能力 用無血清的培養基將基質膠稀釋，每孔20μl 基質膠固定，置于37℃恒溫箱中放置40min。取對數生長期SACC-LM 細胞，用不含血清的RPMI-1640 培養液懸浮，細胞計數至8×104個/ml，上室加入細胞懸液200μl，下室加入500μl 含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液。置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，24h 后多聚甲醛固定30min，結晶紫染色，PBS 潤洗多次，晾干后于倒置顯微鏡下觀察，選取合適平均視野拍照計數。實驗重復3 次。

1.9 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期SACC-LM 細胞，細胞計數至1×106/ml，接種于6 孔板中，待細胞融合度至80%后，用20μl 槍頭尖劃平行的直線，PBS 洗3 次，用無血清培養基置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，取相同位置分別于0、24、48、72h 拍攝。實驗重復3 次。

1.10 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。呈正態分布計量資料以（±s）表示，用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SACC-83、SACC-LM 細胞中MCM7 表達 惡性程度較低的SACC-83 中MCM7 表達水平低于惡性程度較高的SACC-LM。見圖1。

2.2 驗證siRNA 轉染效率 3 組干擾組SACC-LM 細胞中MCM7 蛋白表達水平低于NC 組，選取si-MCM7序列1、3 組進行細胞功能實驗，分別命名為si-MCM7-1 組和si-MCM7-2 組。見圖2。

2.3 細胞增殖能力 細胞克隆實驗結果顯示，第96小時，干擾1、2 組SACC-LM 細胞集落形成密度小于NC 組（P＜0.05）。CCK-8 結果顯示，干擾1、2 組SACC-LM 細胞在第24、48、72h 的細胞存活率低于NC 組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 細胞侵襲能力 Transwell 小室實驗結果顯示，干擾1、2 組SACC-LM 細胞侵襲數目低于NC 組（P＜0.05）。見圖4。

2.5 細胞遷移能力 細胞劃痕實驗結果顯示，干擾1、2 組SACC-LM 細胞遷移能力低于NC 組（P＜0.05）。見圖5。

圖1 MCM7蛋白在SACC-83和SACC-LM中的表達

圖2 細胞轉染后MCM7蛋白在SACC-LM中的表達

圖3 MCM7干擾對細胞克隆（A、B）和細胞增殖（C）的影響

圖4 MCM7干擾對細胞侵襲（D、E）的影響

圖5 MCM7干擾對細胞遷移的影響

3 討論

RNA 干擾技術（RNA interference，RNAi）是研究生物基因功能的重要工具，siRNA 是RNAi 的起始誘導物，參與形成沉默復合體，結合mRNA 切割使其斷裂、降解，抑制靶基因表達［7］。本實驗定制與MCM7具有同源性序列的雙鏈RNA，轉染，引起MCM7 基因沉默，研究其相關生物學功能，驗證其作為癌基因促進SACC 進展的可能性。

MCM 蛋白在細胞中常以MCM2～7 六聚體發揮生物學功能，其為DNA 的復制許可復合物，在G1 期和S 期對細胞周期具有調控作用，與細胞增殖及腫瘤形成等關系密切［6］。MCM7 是MCM 核心三聚體之一，在MCM 蛋白作用過程中起重要作用［8］。

近年來，增殖標志物在腫瘤評估中發揮重要作用［9-12］。MCM7 是多種惡性腫瘤的重要增殖標志物［9-11］。Choy 等［11］報道食管鱗狀細胞癌的病變程度增加，MCM7 蛋白表達程度增加，表明MCM7 表達與疾病進展呈正相關，因此在評估食管病變中MCM7 可能作為一個敏感的增殖標志物發揮關鍵作用。已有研究發現MCM7 的表達可輔助診斷部分頭頸部惡性腫瘤，并且可以預測疾病預后。MCM7 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達率遠高于其在甲狀腺腺瘤與結節性甲狀腺腫中的陽性表達率［13］。鼻腔鼻竇鱗狀細胞癌中MCM7的表達水平隨著腫瘤分化程度的下降而升高［14］。Wen等［15］研究發現，T 分期晚期、鄰近組織侵襲、神經侵襲和預后不良的SACC 患者病變組織中有更高MCM7表達可能。生存分析顯示，MCM7 水平較高的患者術后無病生存期（Disease Free Survival，DFS）較短，預后較差。表明MCM7 可能通過調節異常細胞增殖來驅動惡性演進，從而預后不良。且在SACC 中，MCM7是比MCM3 更可靠的增殖標志。Wen 等［15］研究在組織學證明MCM7 可能作為癌基因促進涎腺腺樣囊性癌的進展，但在細胞學層面尚未驗證。

SACC-LM 是涎腺腺樣囊性癌肺轉移細胞株，MCM7 在SACC-LM 中的表達高于SACC-83，提示MCM7 的表達可能與腫瘤惡性程度相關。本研究結果顯示，干擾組（si-MCM7-1 組、si-MCM7-2 組）與對照組比較，細胞增殖能力、侵襲能力及遷移能力均降低（P＜0.05），于細胞學層面證明MCM7 可能通過調節異常細胞增殖來驅動惡性演進，與組織層面實驗結果一致［15］。這可能是由于在DNA 復制中，MCM7 對于MCM2-7 解旋酶中的ATP 酶活性起到關鍵性的作用，抑制其表達可抑制細胞增殖，細胞增殖失控是惡性腫瘤侵襲、遷移的特征。已有研究顯示MCM7 可能通過MCM7-MAPK-細胞周期蛋白D1 依賴性信號傳導途徑來促進癌癥進展［16］有關通路。MCM7 有望成為SACC的治療靶點，通過下調MCM7 蛋白，或能改善SACC的預后。