線粒體基因組D環區基因突變與結節性甲狀腺腫瘤的相關性研究

范希景 傅媛 方莉萍 項曦 王金華 浮苗

線粒體DNA（mtDNA）特別是非編碼控制區（D-loop 區）突變在宮頸癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、肺癌和腎細胞癌中均有發現，是腫瘤研究領域中的熱點［1-2］。線粒體除提供能量和產生活性氧（ROS）外，還參與細胞凋亡，其D-loop 區含有控制mtDNA 復制和轉錄的調控序列［3］。甲狀腺腫瘤有逐年增高的趨勢，其發病機制和治療引起廣泛關注［4］。結節性甲狀腺腫瘤雖是良性病變，但有合并癌及癌變的可能性。本文探討mtDNA D-loop 區突變在結節性甲狀腺腫瘤致病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2018 年4 月至2019 年4 月本院無遺傳關系的結節性甲狀腺腫瘤患者74 例，均由＞2位病理醫師診斷。排除其他組織、臟器腫瘤；糖尿病、高血壓；已接受放化療和藥物治療；與線粒體突變有關疾病者。男女比例約1 ∶2，平均年齡（47.41±10.59）歲。收集同一患者的腫瘤組織和附近正常組織（距離腫瘤組織＞5cm），以及外周靜脈血2ml。本項目經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）DNA 抽提：提取組織和血液細胞總DNA，使用DNA 提取試劑盒（天根有限公司，中國）。（2）PCR 擴增：設計用于擴增mtDNA D-loop 區域的引物序列，L15975F: 5'-CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3'，H794R: 5'-AGGCTAAGCGTTTTGAGCTG-3'。使用PCR擴增試劑盒（TaKaRa，日本）進行PCR，在PCR 反應管中依次加入下列物質：2×PCR Premix 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板DNA2μl，滅菌雙蒸水補足至終體積為50μl。PCR 擴增：95℃預變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，35 個循環；72℃延伸4min 擴增。取2μl 反應產物，在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。對于擴增效果良好且足量的樣品，進一步進行純化和測序。（3）測序：委托杭州擎科生物公司進行測序，所有樣品均進行雙向測序。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0 統計學軟件。計量資料以（±s）表示，用t 檢驗；計數資料以n 表示，用卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR 擴增結果 所有結節性甲狀腺腫瘤組織、瘤旁正常組織和外周血均擴增出1543bp 片段，見圖1。

2.2 結節性甲狀腺腫瘤患者mtDNA D-loop 區多態性變化 本研究中74 例結節性甲狀腺腫瘤患者，共發現107（303-309 按一個點）個多態性變異，人均變異數為1.45 個，所有變異均有報道，如A73G，G103A，A263G 等。劍橋序列中303-309 位點共有7 個C 堿基，稱之為C7，在303-309 位點會插入或缺失若干個C 堿基，插入一個C 堿基即C8，兩個C 堿基為C9，以此類推；另外也會在523 缺失A 堿基，524 位點缺失C堿基。有10 例標本出現以上多態性改變，見表1。

圖1 mtDNA D環擴增產物瓊脂凝膠電泳圖

表1 結節性甲狀腺腫瘤mtDNA D-loop 區部分多態性變化

2.3 結節性甲狀腺腫瘤患者mtDNA D-loop 區點突變 13 例患者攜帶mtDNA D-loop 區點突變，突變率為17.57%（13/74），出現A-C，T-C，delAC、G-C 等基突變，異質性為38.46%（5/13）。其中10 例患者均攜帶HVR-I 區（16024～16324）和HVR-II 區（63～322）兩個高變區突變，其中HVR-II 區占53.85%（7/13）。見表2，圖2。

表2 甲狀腺腫瘤患者 mtDNA D-loop 區點突變

圖2 測序結果堿基替換圖

2.4 結節性甲狀腺腫瘤患者臨床資料分析 mtDNA D-loop 區突變組與非突變組比較，各臨床指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 結節性甲狀腺腫瘤患者臨床資料分析（±s）

表3 結節性甲狀腺腫瘤患者臨床資料分析（±s）

注：T3代表三碘甲狀腺氨酸，T4代表甲狀腺素，TSH代表促甲狀腺素，FT3代表游離三碘甲狀腺原氨酸，FT4代表三碘甲狀腺氨酸

臨床指標 mtDNA D-loop非突變患者（n=61）mtDNA D-loop突變患者（n=13） P值性別比（男∶女） 21∶41 2:11 ＞0.05年齡 45.72±11.33 50.32±12.66 ＞0.05有家族史例數 4 1 ＞0.05腫瘤大小（cm2） 5.24±5.07 6.22±4.23 ＞0.05 T3 1.57±0.30 1.62±0.08 ＞0.05 T4 113.80±26.02 108.67±13.4 ＞0.05 TSH 1.45±0.86 1.32±0.97 ＞0.05 FT3 4.38±0.41 4.29±0.63 ＞0.05 FT4 13.16±2.4 12.54±2.21 ＞0.05

3 討論

線粒體基因組特別易發生突變，是由于細胞器中產生高水平的活性氧（ROS）和低水平的錯配修復基因（MMR）［5-6］，且D-loop 區是人類線粒體基因組中最可變部分［7］。研究發現，尤其是HVR-I 和HVR-II這兩個高變區，堿基替換率高于mtDNA 其他區域6～8倍［8］。然而，目前對mtDNA 突變位點的研究大多在惡性腫瘤中，國內外研究人員已在直腸癌、胃癌、甲狀腺乳頭狀癌及乳腺癌中檢測到相應的mtDNA 突變，突變率最高達61%［9-11］。

本研究對74 例結節性甲狀腺腫瘤患者mtDNA D-loop 區測序發現107 個多態性位點，人均變異數為1.45 個。mtDNA nt303～309 區域是D-loop 區最常發生變異的區域，插入或缺失1～3 個PloyC 結構［12］。在nt303～309 區域有9 例標本均存在1～3 個堿基C 插入的多態性改變。nt303～309 區域是負責RNA-DNA 的形成，從而開始mtDNA 的復制，這個區域的一些嚴重突變可能對腫瘤細胞的生長有一定的影響［13］。Maximo V 等［14］檢測突變率分別達50%（15/30）和47.6%（17/36），這些高頻突變反映甲狀腺腫瘤mtDNA 的不穩定性。Ding 等［15］在101 例甲狀腺腫瘤（含結節性甲狀腺腫、腺瘤和甲狀腺乳頭狀癌）的檢測中發現在瘤前病變中突變即存在，并隨腫瘤的發生而增加。本研究中檢出13 例攜帶mtDNA D-loop 區點突變，突變率為17.57%（13/74），主要集中在兩個高變區（HVR-I和HVR-II），其中HVR-II 區占53.85%（7/13），突變是A-C、T-C 等轉換，通常導致其相應蛋白質的中度或高度保守氨基酸的變化。這些數據表明mtDNA突變可能在結節性甲狀腺腫瘤的發生中起重要作用，鑒于mtDNA 突變存在于良性多結節增生中，其可能參與腫瘤發展的早期階段。

本研究中發現有5 例結節性甲狀腺腫瘤攜帶異質性突變，提示突變細胞具有選擇性生長優勢，在腫瘤細胞增殖過程中逐漸在數量上占優。由于mtDNA 分子在細胞內的復制優勢，突變可能會被放大，mtDNA 擴增后的細胞由于其克隆生長優勢可能會占據整個種群［16］。通過分析D-loop 區突變狀態和臨床病理特征間的相關性，發現D-loop 區突變組與非突變組在年齡、性別、是否有家族史、腫瘤大小、以及甲狀腺五項功能檢測差異無統計學意義。這可能是腫瘤發展過程中的一個早期事件，在腫瘤演變的全過程中持續存在。

綜上所述，本研究確定了D-loop 區在結節性甲狀腺腫瘤中是一個具有高度多態性和較高突變率的區域。雖然，mtDNA D-loop 區突變和臨床病理參數間無相關性，但能夠為mtDNA D-loop 區突變和結節性甲狀腺腫瘤的發病機制提供一定的基礎。mtDNA 在腫瘤發生過程中的變異，有望成為腫瘤診斷、預后和治療新的靶生物標志物。