妊娠期肝內膽汁淤積癥產婦胎盤血流灌注及AQP1表達的相關性研究

丁盛娣 唐杰 徐彬 張文淵

妊娠期肝內膽汁淤積癥（ICP）是妊娠期特有的并發癥，孕婦預后良好，但可導致胎膜早破、早產、胎兒宮內窘迫、羊水胎盤糞染及不可預測的胎兒突然死亡、新生兒顱內出血等不良妊娠結局［1］，其病理機制尚不明確。近年來研究表明，ICP 孕婦血清中高濃度膽汁酸可通過促進游離胎盤絨毛間隙狹窄，胎兒胎盤的血循環受阻，胎盤血流阻力增加，胎兒宮內缺血缺氧，最終導致胎盤灌注不足，從而影響胎兒預后不良的發生率升高［2］。水通道蛋白1（AQP1）是一種高度保守的疏水跨膜結合蛋白，主要表達于紅細胞膜和血管內皮細胞，廣泛分布于人體的各個組織，主要作用是顯著增加細胞膜對水的通透性，參與水的分泌、吸收及細胞內外水的平衡調節。本文探討ICP 孕婦與胎盤灌注及胎盤組織上AQP1 mRNA 和蛋白表達的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015 年1 月至2018 年10 月本院產科急診剖宮產的ICP 孕婦30 例為ICP 組，ICP 診斷標準：（1）生化指標：血清總膽汁酸≥10μmol/L，肝膽酸≥10.75μmol/L；（2）臨床癥狀：有或無瘙癢；有或無黃疸。且均未接受過任何藥物治療的患者。同期選取無任何并發癥的正常足月妊娠剖宮產的產婦30例為正常對照組。納入標準：產婦年齡24～28 歲，均系足月單胎，無其他妊娠合并癥和并發癥，如：糖尿病、高血壓、心血管疾病或者自身免疫疾病等，無催產素引產史，無藥物服用史，無過期妊娠、胎兒畸形、胎兒生長受限及胎膜早破。本項目經本院倫理委員會批準，所有產婦均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）材料：Real-Time PCR 反應試劑均購自美國應用生物系統公司（ABI）；引物GAPDH、AQP1、委托美國ABI 公司合成；兔抗大鼠AQP1 抗體（Abcam 公司），HRP 標記羊抗人IgE 二抗購于北京中杉金橋公司；化學發光底物試劑盒垂直板型電泳儀、膜轉移系統、凝膠成像系統均購自Bio-Rad 公司；低溫高速冷凍離心機購自Eppdof 公司；彩色多普勒超聲診斷儀購自美國GE 公司。（2）術前B 超監測：剖宮產術前床邊B 超測量子宮動脈血流阻力指數（RI）、搏動指數（PI），以評估孕婦子宮胎盤灌注狀態。（3）取材：符合診斷標準及納入標準的產婦剖宮產術中胎盤娩出離體后取胎盤、胎膜及臍帶組織，分裝后置入-80℃冰箱保存備用。（4）檢測方法：①兩組足月孕婦取仰臥位進行超聲檢查，探頭頻率為3.5MHz，先對胎兒雙頂徑、胎盤、臍帶、羊水等各個部位的情況進行檢查，最后掃查胎盤基底部的子宮螺旋動脈，連續獲取5 個心動周期的血流信號，計算RI 和PI。②Real-time PCR 檢測胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 mRNA 表達:Trizol 試劑盒提取胎盤、胎膜及臍帶中的總RNA，采用M-MLV 逆轉錄酶逆轉錄為cDNA，實時定量PCR 檢測AQP1 的表達，25μl反應體系包括：20×TaqMan Gene Expression Assay 1.25μl，2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μl，cDNA 模 板3μl，補DEPC 無 菌 水 至25μl。PCR 循環參數為：95℃ 10min 預變性；然后95℃ 15s，60℃ 1min，并檢測熒光信號，共40 個循環。引物: AQP1:正義鏈為5'-GGAGATGAAGCCCAAATAGAG-3'，反義鏈 為5'-GCTCTGAGACCAGGAAACAGA-3'；GAPDH 正義鏈為5'-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，反義鏈為5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3'。GAPDH 作 為 內參。每個樣本重復3 次取平均值，反應結束后得出熒光反應曲線及CT 值。采用2-ΔΔCT 方法進行相對定量。③Western-blot 法檢測胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 蛋白表達：蛋白裂解液提取胎盤、胎膜及臍帶中蛋白質，用BCA 法測定蛋白質的濃度，制備聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）（12%分離膠，5%積層膠），取各樣本30μg 進行蛋白質的SDS-PAGE，電泳結束后切取目標蛋白，半干轉法轉移至PVDF 膜，4% 脫脂牛奶封閉2h 后加入一抗（兔抗，1 ∶1000）4℃過夜，洗膜后加入HRP 標記的二抗（鼠抗，1 ∶2000）孵育，洗滌后與ECL 發光試劑反應，曝光洗片，掃描圖像后Bio-Rad 圖像分析系統計算各條帶的灰度值，以β-actin 作為內參進行標準對照。每組實驗重復3 次。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0 統計學軟件。正態分布計量資料以（±s）表示，采用t 檢驗，計數資料比較采用Mann-Whitney U 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦胎盤灌注的超聲特征 ICP 組孕婦子宮螺旋動脈PI 和RI 均顯著高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 ICP組與正常對照組孕婦胎盤灌注的超聲參數［m/s，（±s）］

表1 ICP組與正常對照組孕婦胎盤灌注的超聲參數［m/s，（±s）］

注：與正常對照組比較，*P＜0.05

組別 n PI RI ICP組 30 0.631±0.085* 0.497±0.043*正常對照組 30 0.302±0.030 0.332±0.002

2.2 兩組胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 mRNA 的表達 Real-time PCR 結果顯示，ICP 組產婦胎盤、胎膜及臍帶中AQP1mRNA 的表達均較正常對照組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），且ICP 組中胎盤、胎膜中表達量較臍帶中表達量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 ICP組及正常對照組各組織中AQP1mRNA的表達（±s）

表2 ICP組及正常對照組各組織中AQP1mRNA的表達（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05

組別 n 胎盤 胎膜 臍帶ICP組 30 6.0237±1.276* 3.176±0.961* 5.997±0.803*正常對照組 30 1.045±0.141 1.178±0.254 1.031±0.200

2.3 兩組胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 蛋白的表達 Western blot 結果顯示，ICP 組產婦胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 蛋白的表達均較正常對照組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），且ICP 組中胎盤、胎膜中表達量較臍帶中表達量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 ICP組和正常對照組各組織中AQP1蛋白質的表達

3 討論

有學者對ICP 產婦的胎盤病理檢查發現胎盤小葉存在改變，絨毛間隙明顯充血水腫，胎盤血流量不足，致使胎兒不能從母體中攝取足夠的營養和氧氣，繼而影響其生長發育［3］。體外實驗發現，高濃度膽汁酸有濃度依賴性血管收縮作用，可使胎盤絨毛靜脈痙攣，影響胎盤血流灌注，進而影響胎兒營養及氧的交換，導致胎兒慢性低氧，甚至突然死亡［4］。本資料顯示，ICP 發生時子宮動脈血流阻力指數及搏動指數均較正常對照組明顯增加，從影像學上闡明胎盤血流灌注不足的存在，對早期干預、防止不良妊娠結局發生有較好的提示作用。

AQP1 是第一個被發現并認識的水通道蛋白，目前對其分子結構和生化特性的研究較為深入，其廣泛分布于人體的各個組織，在產婦胎盤組織表達也多次被報道［5-6］。其不僅能影響機體的水和甘油代謝，且與羊水生成、轉運也密切相關，在影響胎盤血流灌注方面的研究也初有成果［7］，但AQP1 在ICP 中是否參與胎盤血流灌注不足的問題尚未見報道。

本資料結果顯示，ICP 組產婦胎盤、胎膜及臍帶上AQP1 的表達較正常對照組明顯升高，表明ICP 發生時胎盤灌注嚴重不足，AQP1 發生代償性改變以期增加胎盤的血流。Zhang 等［8］研究中，采用實時定量PCR 和免疫組化方法，證實AQP1 在人胎盤的血管內皮細胞中有表達，認為AQP1 在維持胎盤灌注方面起重要作用。陳利瓊等［9］研究發現子癇前期組胎盤上AQP1 的表達較正常妊娠組明顯上調，提示胎盤組織中AQP1 的表達與子癇前期胎盤血管痙攣、胎盤灌注不足相關。

綜上所述，ICP 胎盤發生灌注不足時，AQP1 會發生代償性增加，提示可以對ICP 導致的不良妊娠結局提前干預，后續作者將對AQP1 在ICP 孕婦胎盤中作用的信號通路進一步研究。