甘草地上部分總黃酮不同提取方法及其抗氧化活性研究*

薄穎異，張玥輝，楊 柳，崔 潔，王文全，，3，侯俊玲，3

（1.北京中醫藥大學，北京 102488；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京 100102）

甘草又名國老，《中華人民共和國藥典》中記載為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根和根莖[1]。甘草據史料記載，最早產于東北三省，現多集中分布在西北、東北、華北地帶，主要是以新疆、內蒙古自治區，甘肅等地為主要產區[2-4]。甘草應用于古方當中已有近千年。更有“十方九草”、“無草不成方”之說，故稱“國老”。

甘草傳統入藥部位是根及根莖，但其地上部分資源同樣豐富，據文獻報道適當割取地上部分有利于根及根莖活性物質的積累[5-6]；且其黃酮類活性成分具有諸多藥理活性，例如抗氧化[7-8]、抑制腫瘤細胞和癌細胞的生長和發展[9-10]、雌性激素樣作用，對前列腺炎，病原微生物感染、肝損傷、消化系統疾病、痙攣及變態反應等癥狀具有良好療效[11-14]。

為進一步開發利用新資源，全面高效的提取方法的研究必不可少，因黃酮類化合物結構和種類的多樣性，提取方法也是多種多樣，常見的有溶劑提取法[15]、超聲提取法[16-17]、浸漬法[18]、超臨界萃取[19]等方法；然而國內提取方法研究大多局限于實驗室，并未涉及實際生產領域。

在此背景下，研究首次將工廠提取方法與實驗室提取方法進行對比考察，并因其成分多樣，故加入不同提取溶劑提取進一步對比研究；工廠提取方法常見為回流提取，實驗室提取方法常見有水煎煮，超聲提取，回流提取，故本實驗將一同比較上述提取方法；為了全面對比甘草地上部分活性成分，根據相似相溶原理，提取溶劑的選擇按照極性由大到小設計為乙醇，正丁醇，乙酸乙酯，石油醚；本實驗以總黃酮提取率作為評價指標，并通過體外抗氧化活性評價了甘草地上部分總黃酮的1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）清除能力及還原力，從而篩選出最適提取方法及提取溶劑，為后續甘草地上部分開發利用奠定理論基礎，提供切實可行的提取方案。

1 材料與方法

1.1 實驗原材料 甘草地上部分來自甘肅省酒泉市瓜州縣河東鄉2018年9月采收的甘草地上部分，材料由中國醫學科學院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.，也稱烏拉爾甘草）的干燥地上部分；采收樣品經自然陰干和磨粉機粉碎，然后過40目篩常溫干燥器內貯存備用。

1.2 實驗試劑 水（娃哈哈集團有限公司）；甲醇（美國FISHER公司，色譜純）；乙腈（美國FISHER公司，色譜純）；甲醇（分析純，北京化工廠）；乙醇（分析純，北京化工廠）；正丁醇（分析純，北京化工廠）；乙酸乙酯（分析純，北京化工廠）；石油醚（分析純，北京化工廠）；氫氧化鉀（分析純，北京化工廠）；槲皮素（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；DPPH（東京化成工業株式會社生產）；磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6，上海源葉生物科技有限公司）；鐵氰化鉀（分析純，上海源葉生物科技有限公司）；三氯乙酸（分析純，羅恩試劑）；三氯化鐵（分析純，北京百靈威科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 40目標準檢驗篩（篩孔直徑0.45mm，北京祥宇偉業儀器設備有限公司）；CP224C電子天平（奧豪斯上海儀器有限公司）；BJ-150型粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；KH-500DE型數控超聲波清洗器（北京鑫科奧科技有限公司）；UV-2600紫外可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；精宏DZF-6050真空干燥箱（上海和呈儀器制造有限公司）；鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司101-2AB）；湘儀H1650離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

1.4 數據處理軟件 實驗數據采用SAS9.3采用軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 實驗方法

2.1 總黃酮提取率測定

2.1.1 對照品制備 精密稱取槲皮素標準品0.0222g，以少量甲醇溶解，后定容于100 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為0.222 0 mg/mL的標準溶液，4℃冰箱冷藏保存[20-21]。

2.1.2 標準曲線制備 分別精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.2和1.8 mL的槲皮素溶液于10 mL容量瓶中，甲醇補足至2 mL，加入10%氫氧化鉀（KOH）溶液1mL，充分搖勻，靜置5 min，用娃哈哈純凈水定容至刻度，充分搖勻后于400 nm處測定吸光度值。以吸光度A為縱坐標，槲皮素濃度C為橫坐標，用EXCEL繪制標準曲線，得回歸方程：Y=30.473X-0.011（r2=0.999 4），結果表明槲皮素濃度在 0.259～1.211 mg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

2.1.3 總黃酮提取率測定 精密稱取總黃酮提取物0.100 0 g，適量甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中。精密量取提取物溶液0.25 mL于10 mL容量瓶中，按照2.1.2中方法進行顯色并測定其吸光度，根據上述標準曲線計算總黃酮提取率。

2.1.4 總黃酮提取率計算公式

其中y代表總黃酮提取率（mg/g），c代表提取物濃度（mg/mL），m代表稱取的提取物的量（mg），M2代表提取后所得提取物的量（mg），M1代表提取原藥材的量（g）。

2.2 不同提取方法對比

2.2.1 水煎煮提取 精密稱取甘草地上部分粉末5.000 0 g于100 mL圓底燒瓶中，溫度100℃，液料比10∶1，提取時間90 min，提取2次。過濾，合并濾液，干燥，稱質量。計算出膏率及總黃酮提取率。重復3次。

2.2.2 實驗室回流醇提 精密稱取甘草地上部分粉末5.000 0 g于100 mL圓底燒瓶中，提取溫度75 ℃，液料比 10∶1，70%乙醇溶液，提取時間 90 min，提取2次。過濾，合并濾液，干燥，稱質量。計算出膏率及總黃酮提取率。重復3次。

2.2.3 實驗室超聲醇提 精密稱取甘草地上部分粉末5.000 0 g于100 mL錐形瓶中，提取溫度75℃，功率500 W，70%乙醇溶液，液料比10∶1，提取時間30 min，提取2次。過濾，合并濾液，干燥，稱質量。計算出膏率及總黃酮提取率。重復3次。

2.2.4 工廠回流醇提 稱取甘草地上部分粗粉50.000 kg，提取溫度 75 ℃，液料比 6∶1，70%乙醇溶液，提取時間90 min，提取2次。過濾，合并濾液，干燥，稱質量。計算出膏率及總黃酮提取率。

2.3 提取溶劑考察[22]精密稱取甘草地上部分粉末8.000 0 g于100 mL錐形瓶中浸漬，液料比10∶1，提取時間24 h，提取1次，分別使用無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚進行提取。過濾，合并濾液，干燥，稱質量。計算出膏率及總黃酮提取率。重復3次。

2.4 體外抗氧化能力測定

2.4.1 DPPH清除能力的測定 準確稱取一定量的甘草地上部分提取物物粉末，分別加入相應量的甲醇配制成 0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/mL 的待測樣品溶液。準確稱取DPPH試劑45 mg，以無水乙醇溶解至1 000 mL容量瓶，充分搖勻，即得0.045 mg/mL DPPH溶液，避光低溫保存。分別取1 mL待測樣品溶液和3 mL DPPH溶液混合搖勻，室溫且避光反應30 min，于517 nm波長下測定其吸光度值。以待測液溶劑為空白對照，記為A空白；1 mL待測樣品溶劑和3 mL DPPH溶液混合物，記為A對照；1 mL待測樣品溶液和3 mL DPPH溶液，記為A樣；計算樣品自由基清除率[23-24]。

2.4.2 還原力的測定 準確稱取一定量的甘草地上部分提取物物粉末，分別加入相應量的甲醇配制成 0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mg/mL 的待測樣品溶液。分別取待測樣品溶液1 mL和2 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH=6.6）和1 mL的1%鐵氰化鉀溶液，得混合物A，在50℃水浴保溫20 min，然后加入2 mL的10%三氯乙酸溶液，在3 000 r/min條件下離心15 min。取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水及0.5 mL的0.1%三氯化鐵溶液，得混合待測物B，于700 nm波長下測吸光度[25-26]。

吸光度值越大，樣品的還原力越強。

3 結果與分析

3.1 不同提取方法對甘草地上部分總黃酮提取率的影響 水煎煮作為最原始的提取方法，具有設備簡單，溶劑易得的優點；超聲提取作為實驗室常用的提取方法，能夠快速破壞植物的細胞，加速藥材在提取溶劑中的溶解，提取效率高；回流提取作為傳統常規提取方法，與水煎煮相比，不易揮發，且能充分提取，生產時常常采取此方法。工廠提取設備巨大，投料較為粗放，無法控制是否會有莖和果實等雜質，且料液比及溫度等條件都難以達到實驗室內的精細條件，從而活性成分的提取會受到相應的影響。

總黃酮提取率由高至低依次為回流實驗室醇提＞實驗室超聲醇提＞回流工廠醇提＞水煎煮法。出膏率由高至低依次為回流實驗室醇提＞實驗室超聲醇提＞回流工廠醇提＞水煎煮法，見表1。

表1 不同提取方法的甘草地上部分總黃酮提取率和出膏率

實驗室超聲醇提與實驗室回流醇提之間沒有顯著性差異，但兩者所用時間差距明顯，后續實驗可根據目的進行方法選擇；實驗室回流醇提與工廠回流醇提具有顯著性差異，證明工廠生產提取與實驗室提取有一定差距，具有一定的損失；水煎煮法的出膏率高、黃酮提取率低，表明其提取的大多為大極性物質，多糖和蛋白質類雜質比較多，應用價值不高；而其余3種提取方法所得提取物較水煎煮法相比成分更加全面均勻。數據表明實驗室超聲提取或回流提取提取效果較好。

3.2 不同提取溶劑對甘草地上部分總黃酮提取率的影響 按照相似相溶原理，極性越大的試劑越能提取出極性大的物質，反之亦然。

總黃酮提取率由高至低依次為乙酸乙酯提取＞正丁醇提取＞乙醇提取＞石油醚提取，每組數據之間均有顯著性差異。出膏率由高至低依次為乙醇提取＞正丁醇提取＞乙酸乙酯提取＞石油醚提取，每組數據之間均有顯著性差異，見表2。

表2 不同提取溶劑甘草地上部分總黃酮提取率和出膏率

數據表明，乙醇能提出較多的黃酮但也能提出部分多糖，所以造成黃酮提取率較低，結合出膏率數據，總黃酮量較高；正丁醇和乙酸乙酯的黃酮提取率較高，但出膏率一般，且有機試劑價格高，有毒性。石油醚結合總黃酮提取率和出膏率數據，提取得到的黃酮類活性成分非常少，不予考慮。綜上，考慮經濟效益及安全性，選擇乙醇比較恰當。

3.3 體外抗氧化能力測定結果分析

3.3.1 DPPH清除能力結果分析 DPPH自由基是一種穩定的自由基，自由基清除劑與DPPH的單電子配對，隨其濃度降低顏色會逐漸褪色，顏色越淺，吸光度越小，表明DPPH清除率越高，抗氧化能力越強。

如表3所示，以VC作為對照品，隨著濃度依次遞增，VC和不同提取方法所得受試物的DPPH清除能力也隨之增強，呈現先上升后平穩的趨勢。在所有受試物中，VC作為對照品，其DPPH清除能力最強；工廠回流醇提較實驗室超聲或回流相比稍高，或許因其提取量大，混合不均勻，導致取樣部分黃酮濃度稍高，或與其實驗本身有關，DPPH極易氧化，造成數據不穩；水煎煮法所得黃酮提取率最低，相同濃度下所含黃酮量最少，其DPPH清除能力最弱。

如表4所示，以VC作為對照品，隨著濃度依次遞增，VC和不同提取溶劑所得受試物的DPPH清除能力也隨之增強，呈現先上升后平穩的趨勢。在所有受試物中，乙酸乙酯提取受試物的DPPH清除能力基本與VC相當，乙醇與正丁醇稍低；與上述水煎煮法同理，石油醚提取受試物的DPPH清除能力最弱。

3.3.1 還原力結果分析 還原力可以在某些方面代表物質的抗氧化能力，現被廣泛應用于抗氧化活性相關研究中[27]。

在700 nm波長條件下測定其吸光度值，吸光度值越大，樣品的還原力越強。

如表5所示，以VC作為對照品，隨著濃度依次遞增，VC還原力基本穩定；不同提取方法所得受試物的還原力也隨之增強，呈現先上升后平穩的趨勢。在所有受試物中，VC作為對照品，其還原力最強；實驗室回流醇提與實驗室超聲醇提基本相當，工廠回流醇提稍差；水煎煮法所得黃酮提取率最低，相同濃度下所含黃酮量最少，其還原力最弱。

如表6所示，以VC作為對照品，隨著濃度依次遞增，VC還原力基本穩定；不同提取溶劑所得受試物的還原力也隨之增強，呈現先上升后平穩的趨勢。在所有受試物中，VC的還原力最強；樣品中乙酸乙酯同樣是還原力最強的，正丁醇和乙醇稍低；與上述水煎煮法同理，石油醚提取受試物的還原力最弱。

4 結論與討論

文章通過對比不同提取方法及不同提取溶劑，以總黃酮提取率及抗氧化活性為評價指標，優選出提取效果較好的提取方法和提取溶劑。實驗室超聲醇提和實驗室回流醇提效果較好，可根據實際情況進行選擇；考慮經濟效益及安全性，最適提取溶劑為乙醇；所得黃酮提取物都具有一定的抗氧化活性，且存在量效依賴關系。

表4 不同提取溶劑提取物的DPPH清除率

表5 不同提取方法提取物的還原力測定

表6 不同提取溶劑提取物的還原力測定

若可以著重研究這幾種方法或者試劑所得提取物的成分及含量區別，可以更好地開展分類黃酮的富集，不同類別的黃酮的抗氧化活性可以進一步研究，以此做到具有針對性的抗氧化劑的開發，為藥食兩用甘草植物資源的開發利用奠定理論基礎，可將其廣泛應用于其他相關領域。