5/6腎切除聯合ISO制備心腎綜合征大鼠模型方法初探*

胡文仲，許 云，李光亞，張童燕，姜 楠，高常柏

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250）

隨著醫療技術發展，心力衰竭與腎臟病患者生存率不斷提高，心腎疾病之間的緊密關系逐漸被發現。臨床治療心腎綜合征手段有限，利尿與超濾為主要治療措施。為探索中醫藥治療心腎共損狀態的作用機制，心腎綜合征實驗模型不可或缺。目前常見的造模方法可分為手術法與藥物注射法兩類[1]，“5/6腎切除術制備心腎綜合征大鼠模型”是經典的制備心腎綜合征模型方法之一，由腎功能衰竭導致心衰也符合心腎綜合征發病機制之一，但通過單一方法制備心腎綜合征大鼠模型往往花費時間較長。查閱相關文獻，課題組最終選擇異丙腎上腺素（ISO）作為本次研究方向，ISO屬非選擇性β受體激動劑，可顯著加快心率，提高心肌收縮力，若是大劑量長時間使用，可直接誘導心肌損傷[2]。因此課題組選擇在腎切除術后低劑量、短時間聯用ISO，以達到縮短腎功能衰竭導致心力衰竭自然病程的目的，且不會直接誘導致心肌損傷，該法可較高程度模擬心腎綜合征疾病過程。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 動物情況 清潔級SD雄性大鼠20只，體質量（150±10）g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 耗材與儀器 ISO（SIGMA）、戊巴比妥鈉、注射用青霉素鈉、注射器（1、5、20 mL）、注射用水、碘伏、明膠海綿、無菌紗布、毛細采血管、促凝離心管、移液槍（100～1 000 μL）、10%中性甲醛溶液等。瑞士Sunrise全自動酶標儀、HH-4恒溫水浴鍋、RT-3000自動洗板機（深圳雷杜）、Eppendorf 5427R臺式高速冷凍離心機等。

1.1.3 檢測試劑 大鼠尿素氮（BUN）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒、大鼠腦鈉尿肽（BNP）ELISA檢測試劑盒、大鼠血肌酐（Cr）ELISA檢測試劑盒，均由武漢純度生物科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模方法 將20只雄性SD大鼠隨機分為2組，正常組9只，手術組11只，正常組大鼠不做處理，手術組大鼠均按“兩次手術法”行5/6腎切除術，手術1周后連續2 d（間隔24 h）皮下注射異丙腎上腺素（分別為2.5、1.5 mg/kg）制備心腎綜合征模型：1）一期手術（左腎2/3切除）：大鼠稱體質量并記錄后，以2%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將大鼠俯臥位固定在大鼠手術臺上，從左側腹緩慢向背部推及腎臟，確定手術區位置，手術區域備皮、碘伏消毒。距左脊肋角1.5 cm處做2 cm左右的長切口，再次從腹側向背側推擠腎臟，使左腎視野充分暴露。用鑷子鈍性分離左腎周圍脂肪層，剝離腎包膜、腎上腺及腎蒂，充分游離腎蒂并用血管鉗夾閉，再用彎剪分別從左腎上下極弧形切除部分腎組織，共切除2/3左腎，隨即使用明膠海綿壓迫兩側切口15～20 s，松開血管鉗并用無菌紗布壓迫止血，待無新鮮出血，將剩余腎臟及周圍組織還納體內，明膠海綿無需取出，可自行吸收。縫合前在腹腔內注入青霉素鈉8萬單位。由內而外逐層縫合肌肉層及皮膚，0.9%氯化鈉注射液、碘伏先后清潔切口及手術區域，術后大鼠先單籠飼養并觀察生命體征，待大鼠完全蘇醒后再放入飼養籠混養。2）二期手術（右腎全切）：于一期手術1周后行右腎全切術，大鼠稱體質量、麻醉、固定、消毒步驟同上，距右脊肋角1.5 cm處做1.5～2 cm的切口，暴露右腎并分離周圍組織、腎包膜、腎上腺及腎蒂，使腎蒂完全游離，用血管鉗夾閉腎蒂，4-0手術線分別結扎血管鉗內、外側腎蒂，手術剪行右腎全切，觀察10～15s，確認切口無活動性出血后，腹腔內注入8萬單位青霉素鈉，由內而外逐層縫合，術后單籠飼養并觀察生命體征。兩次手術共約切除雙腎總質量的5/6。3）大鼠于手術1周后背部皮下注射ISO，連續2 d（間隔 24 h）注射，注射量分別為 2.5、1.5 mg/kg，注射后常規食水飼養6周。

1.2.2 血清采集及檢測方法 大鼠采用眼框內靜脈叢取血法取血。血液收集完畢后靜置20 min，3 500 r/min離心10 min，移液槍采集血清并做好標記。采用ELISA試劑盒檢測。

1.2.3 病理組織采集及觀察方法 觀察6周后處殺所有存活大鼠，解剖并分離心臟及腎臟（空白組大鼠留取左腎），將其置于10%中性甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察心肌細胞，腎小球、腎小管、腎間質及腎血管情況，心肌細胞體積、心肌排列情況、有無充血、水腫、細胞增殖和炎性浸潤、硬化、玻璃樣變性、纖維組織增生等病理變化。病理觀察由天津中醫藥大學第二附屬醫院病理科完成。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行實驗數據分析，符合正態分布的計量資料使用均數±標準差（±s）表示，計量資料兩組間采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 一般情況 造模后，手術組大鼠活動力與空白組相比明顯減弱，反應較慢，多喜蜷縮，活動后喘息明顯，耳廓蒼白，體毛松散、干枯少光澤，被毛生長速度明顯遲于空白組大鼠，攝食量減少，大便成形或稀溏；空白組大鼠活動靈敏，反應積極，體毛茂密、整齊有光澤，耳廓紅潤，進食水正常，大便正常。

2.2 兩組大鼠血清學比較 空白組與手術組BNP、Cr水平在統計學上有統計學差異（P＜0.05），BUN水平無統計學差異。見表1。

表1 兩組大鼠BNP、BUN、Cr水平比較（±s）

表1 兩組大鼠BNP、BUN、Cr水平比較（±s）

注：與空白組相比，*t=-2.335（P＜0.05），△t=-2.510（P＜0.05）。

組別nBNP（pg/mL）BUN（mmol/L）Cr（μmol/L）空白組 9 502.53±203.71 16.39±4.67 195.59±68.42手術組 11 672.09±117.45* 14.47±3.31 254.96±20.83#

2.3 不同時間點大鼠體質量及心臟質量指數比較 造模前兩組大鼠體質量相比無明顯差異，造模后、造模6周后手術組大鼠體質量較空白組均明顯降低，兩組體質量之間比較有統計學差異（P＜0.05），兩組心臟質量指數之間比較有統計學差異（P＜0.05）。心臟質量指數=心臟濕質量/體質量（心臟稱質量前需用濾紙吸干多余血液，減去周圍血管及其他軟組織），可反映心臟代償性增大情況，心功能受損嚴重程度與心肌代償性肥大成正相關，見表2。

表2 兩組大鼠不同時間點體質量及心臟質量指數比較（±s） g

表2 兩組大鼠不同時間點體質量及心臟質量指數比較（±s） g

注：與空白組相比，*P＜0.05。

心臟質量指數（mg/g）空白組 9 173.07±4.77 270.06±30.48 423.83±41.03 4.43±0.50手術組 11 168.86±6.01 238.27±23.47*367.32±35.67*5.27±1.09*組別 n 造模前體質量造模后體質量造模6周體質量

2.4 心腎組織病理學比較

2.4.1 心肌組織HE染色 空白組大鼠心肌細胞大小正常，分布均勻，排列整齊，細胞外基質少且不明顯；手術組大鼠心肌細胞彌漫性肥大增粗，心肌纖維排列紊亂不均勻，心肌輕度充血，可見明顯的心肌細胞腫脹，部分心外膜下心肌細胞間質水腫明顯，結果與心力衰竭動物模型文獻報道[3-4]相一致。見圖1。

圖1 兩組大鼠心肌組織HE染色（×400）

2.4.2 腎臟組織HE染色 空白組腎小球、腎小管及腎間質組織結構正常，未見增生、變性及炎癥細胞浸潤；手術組腎盂輕度擴張，腎間質可見彌漫多灶性淋巴細胞少量漿細胞浸潤，局部纖維組織輕度增生，部分腎小球擴大充血、部分腎小管腫脹、腎小管內可見蛋白管型，局部皮質淺層可見灶性楔形凹陷區，凹陷區腎小管萎縮，間質內可見較多淋巴細胞浸潤，纖維組織增生玻璃樣變，與相關文獻報道[5-6]描述一致，見圖2。

圖2 兩組大鼠腎組織HE染色（×400）

3 討論

目前公認的心腎綜合征共分為5型，本實驗采用了5/6腎切除聯合ISO皮下注射制備心腎綜合征大鼠模型，模擬腎衰竭導致心力衰竭的過程，較符合IV型心腎綜合征發病機制。5/6腎切除造模法是直接使用手術方式切除大部分腎組織，殘余腎臟代償，負荷量明顯增大[5]，在高灌注、高濾過狀態下可代償性增大，最終導致腎功能不全。腎功能衰竭造模過程中，合適的麻醉藥物及劑量是縮短手術時間的捷徑之一，課題組參考《實驗動物學》中介紹的麻醉方法[6]，選擇2%戊巴比妥鈉35 mg/kg腹腔注射麻醉，該劑量麻醉效果良好，注射后1.5～3 min左右起效，可維持麻醉時間30 min以上，起效時間短，作用時間適中，符合腎切除術所需麻醉程度，可供同道參考。在理論上，5/6腎切除大鼠腎衰模型制備后，若給予足夠時間即可導致心肌損傷[8]，這是最理想的心腎綜合征模型，但在時間有限的條件下，選擇聯用ISO加速大鼠心功能不全的建立。因ISO可加快心臟泵速，增加心肌耗氧，使得心肌運動疲勞。因此課題組選擇在腎切除術后低劑量、短時間聯用ISO，以達到縮短腎功能衰竭導致心力衰竭自然病程的目的，且不會直接誘導致心肌損傷，該法可較高程度模擬心腎綜合征疾病過程，而且皮下注射方式較溫和，藥物作用緩慢，可在保證大鼠存活的基礎上同時加速心功能不全模型的建立。大鼠5/6腎切除聯合異丙腎造模方案可靠，造模后可觀察到心腎綜合征大鼠活動力減弱、喘憋，體毛干枯無光澤，體質量增長速度較正常大鼠緩慢，一般情況符合心腎綜合征表現，腎功能主要指標Cr、心功能主要指標BNP及心腎組織病理均較空白組有明顯改變。關于心腎綜合征造模方法國內外尚無統一標準，利用該聯合方法成模時間短、操作難度低，是一種簡捷高效的心腎綜合征造模方法，可以為心腎綜合征動物實驗提供模型基礎，為課題組進一步探討心腎綜合征疾病的藥物治療及機制研究提供了新的途徑。本研究目的在于制備適合臨床治療所需的心腎綜合征大鼠模型，且手術組大鼠的心腎共損狀態表現明顯，與空白組比較存在統計學差異。但該法由于不完全模擬慢性腎衰竭導致心力衰竭的自然病程，可能不適用于研究該病早期發展變化規律，而對于心腎綜合征已發展為心腎共損狀態時的藥物治療評價及機制研究較為合適。另外建議將該模型應用于藥物研究時，嚴格遵循上述操作流程，異丙腎上腺素注射方式及劑量均已提及，若延長注射ISO時間，可能會影響對觀察項造成影響，因有研究發現ISO以劑量依賴的方式損害心室功能[9]。