推拿療法對骨骼肌纖維化大鼠MMP-1和TIMP-1表達的影響*

龐 賡，李 沙，唐新月，趙 娜

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津體育學院，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

急性骨骼肌損傷作為運動性損傷的一種類型，一直呈高發(fā)態(tài)勢，其致病原因多為鈍挫傷或牽拉傷。雖然已有研究證實骨骼肌損傷后具有再生修復(fù)的能力，但嚴重的鈍挫傷可導(dǎo)致骨骼肌纖維斷裂、肌膜遭到破壞、肌核死亡，使其喪失再生功能，這時結(jié)締組織增生，瘀痕修復(fù)占據(jù)主導(dǎo)，骨骼肌出現(xiàn)纖維化[1]。骨骼肌纖維化可導(dǎo)致肌肉彈性不同程度的消退、功能受損、運動能力下降，且具有不可逆性，因此抗纖維化的治療手段一直都是運動醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點。研究顯示，由于致炎細胞的持續(xù)浸潤，成肌細胞可轉(zhuǎn)型為肌成纖維細胞，其過度活化增殖產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)，導(dǎo)致的大量膠原纖維持續(xù)聚集，是骨骼肌纖維化的重要環(huán)節(jié)[2]。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）/金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）的動態(tài)平衡對細胞外基的合成與降解具有調(diào)節(jié)作用[3]。

推拿作為一種綠色、無化學毒副作用的治療方法，針對骨骼肌的各種損傷具有明顯的臨床療效[4]，本研究通過復(fù)制大鼠急性骨骼肌鈍挫傷模型，選用臨床推拿核心手法——按揉法為干預(yù)手段進行治療，觀察其對骨骼肌纖維化的干預(yù)效果，并闡明其機制是否與調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）/金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）平衡相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠 20只，體質(zhì)量（200±20）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號SCKY（京）20140004飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學清潔級動物房。

1.1.2 實驗儀器和主要試劑 TPA-Ⅱ推拿手法測定儀（上海益聯(lián)醫(yī)學儀器發(fā)展有限公司）；Veriti PCR熱循環(huán)儀、熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green試劑盒（天津彬彤生物科技有限公司）；兔抗大鼠多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；BCA蛋白檢測試劑盒（美國Thermo公司）；低速離心機，型號LDZ5-2（北京京立離心機有限公司）。

1.2 骨骼肌鈍挫傷模型的復(fù)制和分組 本研究效仿經(jīng)典鈍挫傷造模法[5]，自制造模裝置，選取SD大鼠腓腸肌部位為造模區(qū)域，以重物垂直下落方式擊打造模，具體操作如下：動物入籠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，調(diào)配10%水合氯醛（0.4 mL/100 g），一次性腹腔注射麻醉；選取大鼠右后肢內(nèi)側(cè)面，距根骨1.5 cm處為造模區(qū)域，標注，備皮；將大鼠仰臥位固定于操作臺上，右后肢外展，伸膝、踝背屈90°，充分暴露標記部位；將面積為1 cm2的圓形接觸裝置緊貼大鼠標記部位，固定；220 g重物由81 cm高度下落垂直擊打接觸裝置，動能2.62 J；將創(chuàng)面無破損、無骨折，擊打部位為標記區(qū)大鼠入組，完成造模。參閱文獻，該造模方式制備纖維化大鼠模型達100%。成模大鼠觀察3 d后，依體質(zhì)量遵數(shù)字隨機法分為模型組和推拿干預(yù)組（n=10）。

1.3 干預(yù)措施 選用TPA-Ⅱ推拿手法測定儀采集并儲存推拿名家王金貴教授手法參數(shù)，建立量化標準；實操人員依標準進行模擬訓練，后經(jīng)測定儀評定，實操人員在力度、頻率與量化標準一致后方可進入實驗組干預(yù)。成模后3日后，依量化標準實施干預(yù)，具體操作流程如下：縛成模大鼠于自制固定裝置，仰臥位，暴露患肢；定位大鼠患處及周邊，依標準按揉施術(shù)；固定時間、每天10 min/次、25 d連續(xù)施術(shù)。

模型組：參照推拿組相同方式予以固定，不施加干預(yù)，10 min/次/d，連續(xù) 25 d。

1.4 標本采集與處理 經(jīng)25 d干預(yù)后，大鼠稱質(zhì)量后調(diào)配10%水合氯醛（0.4 mL/100 g），一次性腹腔注射麻醉，立即解剖并分離大鼠腓腸肌中段，均分為2份，一份用于蘇木精-伊紅（HE）染色；另一份用錫紙包裹后置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)qPCR及Western Blot檢測。

1.5 HE染色 操作步驟：將腓腸肌組織置于4%甲醛固定72 h，改刀，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)脫蠟至水，置于蘇木精液中染色5 min，流水沖洗5min，1%鹽酸乙醇分化3 s，稍后流水浸泡10 min，置入蒸餾水中5 min，經(jīng)伊紅染色2 min，梯度酒精脫水，放入二甲苯中透明，最后用中性樹膠予以封固。鏡下觀察各組大鼠腓腸肌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.6 實時熒光定量核酸擴增（qPCR）檢測大鼠腓腸肌MMP-1、TIMP-1mRNA表達情況 取大鼠造模區(qū)域腓腸肌組織樣品，加入1 mL Trizol試劑與氯仿分離，經(jīng)4℃以下7 000 rpm轉(zhuǎn)速震蕩離心后取出上清液；加入異丙醇經(jīng)振蕩離心后去除上清液，經(jīng)75%乙醇洗滌后再次去除上清液，常溫干燥，加入DEPC，隨即測量RNA的濃度與純度。從Genbank數(shù)據(jù)庫查找出MMP-1及TIMP-1的mRNA序列，參照說明書逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，用SYBR Green法冰上配制20 μL反應(yīng)液進行擴增，具體反應(yīng)條件如下：95℃15 min，預(yù)變性及熱啟動→95℃10 s，變性→60℃30 s，退火→72℃1 min，延伸→40個循環(huán)。所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量。具體的引物序列如：MMP1引物設(shè)計，上游引物5'-TACCATC-CTGCGACTCTTGC-3'，下游引物為：5'-TTCACCCA-CATCAGGCACTC-3'。TMIP1 引物設(shè)計，上游引物：5'-ACACCCCAGTCATGGAAAGC-3'，下 游 引 物 ：5-'AAGAA GCTGCAGGCACTGAT-3'；GAPDH引物設(shè)計，上游引物：5'-AAGAAGGTGGTGA AGCAGG-3'， 下游引 物 ：5'-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT-3'。

1.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠腓腸肌MMP-1、TIMP-1的蛋白表達情況 取大鼠損傷區(qū)域腓腸肌組織，迅速加入液氮1 h后研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑配平，經(jīng)離心震蕩后取上清液測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)95℃煮10 min，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）恒壓電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF），5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入經(jīng)三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl）緩沖鹽溶液和吐溫（Tween）-20稀釋的一抗，4℃搖床過夜。TBST洗膜3次后加入5%脫脂奶粉的二抗，室溫反應(yīng)2 h，TBST洗膜，加ECL顯色3 min，成像系統(tǒng)顯影成像。以GDPH為內(nèi)參照蛋白，運用image J軟件進行定量分析。

1.8 統(tǒng)計學分析 運用SPSS24.0軟件進行采集數(shù)據(jù)的整理分析。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）來表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果分析 對照組大鼠肌纖維排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肌細胞核呈卵圓形，多個核細胞位于肌細胞邊緣。模型組大鼠肌纖維排列紊亂，部分肌纖維出現(xiàn)斷裂情況，并伴有炎癥細胞侵襲，肉眼可見形成大量結(jié)締組織給予推拿治療后，治療組大鼠肌纖維排列較為整齊，伴有輕微腫脹，結(jié)構(gòu)大小均一，結(jié)締組織生成較少，纖維化程度明顯降低，表明推拿治療可有效修復(fù)大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后的肌肉損傷。

圖1 大鼠腓腸肌HE染色（100×）

2.2 熒光定量PCR結(jié)果分析 對比對照組，造模28 d后模型組大鼠造模區(qū)域腓腸肌MMP-1的mRNA相對表達量及MMP-1/TIMP-1的比值明顯降低（P＜0.05），TIMP-1的mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05），說明模型大鼠致纖維化的進程與MMP-1的轉(zhuǎn)錄下調(diào)、TIMP-1的激活及MMP-1/TIMP-1比值下降有關(guān)。經(jīng)25 d的推拿干預(yù)治療后MMP-1的mRNA相對表達量及MMP-1/TIMP-1的比值較模型組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），TIMP-1的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低（P＜0.05），說明推拿干預(yù)可能通過提升MMP-1的轉(zhuǎn)錄水平、升高MMP-1/TIMP-1的比值及降低TIMP-1轉(zhuǎn)錄水平來逆轉(zhuǎn)大鼠鈍挫傷導(dǎo)致的骨骼肌纖維化程度。

表1 各組腓腸肌MMP-1、TIMP-1的mRNA相對表達量及MMP-1/TIMP-1的比值

2.3 Western Blot結(jié)果分析 如表2所示，模型組大鼠造模區(qū)域腓腸肌組織中MMP-1的蛋白相對表達量及MMP-1/TIMP-1比值相比對照組均明顯下調(diào)（P＜0.01）；TIMP-1的蛋白相對表達量明顯上調(diào)。而經(jīng)推拿干預(yù)治療后，其MMP-1的蛋白相對表達量及MMP-1/TIMP-1比值相比模型組均明顯提升（P＜0.01），TIMP-1的蛋白相對表達量明顯下調(diào)，進一步說明推拿干預(yù)治療可能通過提升MMP-1的蛋白水平、下調(diào)TIMP-1的蛋白水平及提升MMP-1/TIMP-1比值弱化大鼠鈍挫傷導(dǎo)致的骨骼肌纖維化程度。

圖2 各組大鼠腓腸肌MMP-1、TIMP-1相關(guān)蛋白印跡圖

表2 各組腓腸肌MMP-1、TIMP-1的蛋白表達量及MMP-1/TIMP-1的比值

3 討論

骨骼肌纖維化是一個多細胞因子參與調(diào)控的復(fù)雜病例變化過程，是骨骼肌纖維損傷重構(gòu)后發(fā)生的病理表現(xiàn)形式[6-7]。

由外部原因造成的骨骼肌鈍挫傷，會導(dǎo)致部分通路暫時激活或限制，并通過精確協(xié)調(diào)，來完成肌肉成分的重建，如損傷嚴重，會造成受傷組織動態(tài)平衡重建受阻，使正常肌纖維被不具備功能性的結(jié)締組織替代。肌束膜是結(jié)締組織的重要組成部分，其主要成分是I型、III型膠原，而I型膠原的過度沉積標志著受傷機體結(jié)締組織大量合成，而這也會導(dǎo)致受損部位ECM的增多[8]。從目前的研究結(jié)果中可以推斷，嚴重鈍挫傷的肌肉組織在其后續(xù)修復(fù)過程中會引起I型、III型膠原的過度合成，進而導(dǎo)致瘢痕產(chǎn)生，嚴重影響肌肉的物理特性。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)受嚴重鈍挫傷后，受損部位III型膠原蛋白水平迅速上升，并于14 d時達到峰值，而I型膠原蛋白水平于損傷后21 d時達到峰值，因此可以推斷，鈍挫傷后骨骼肌前期主要以III型膠原合成為主，而后期則以I型膠原合成為主[9]。

MMPs，即基質(zhì)金屬蛋白酶，作為主要的基質(zhì)降解酶，可降低多種細胞外基質(zhì)，截至目前，MMPs大家族已發(fā)現(xiàn)26個具備相似結(jié)構(gòu)的成員[10-13]。MMPs表達水平升高有助于損傷部位形成新的肌纖維。MMP1作為家族成員之一，屬于間質(zhì)膠原酶，經(jīng)研究表明，MMP1作為降解I型和III型膠原的特異性酶，具備緩解骨骼肌纖維化的作用，并能促進骨骼肌結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)。TIMPs（即基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物），作為MMPs的特異性抑制劑，以共價鍵的形式結(jié)合MMPs并抑制其活性[13]。目前，TIMPs家族已發(fā)現(xiàn)4名成員，其中TIMP-1為MMP-1的內(nèi)源性抑制物，其以1∶1的方式與MMP-1結(jié)合并形成復(fù)合體，最終使MMP-1失去活性。MMP-1/TIMP-1的動態(tài)平衡，極大的影響著MMP-1降解細胞外基質(zhì)的功效。而本實驗的研究結(jié)果表明，經(jīng)嚴重鈍挫傷后的腓腸肌組織其MMP-1的蛋白相對表達量的明顯下調(diào)及其內(nèi)源性抑制物TIMP-1的顯著上調(diào)，必然導(dǎo)致MMP-1/TIMP-1比值下調(diào)，而MMP-1與TIMP-1動態(tài)平衡的破壞將會引起I型、III型膠原合成降解的穩(wěn)態(tài)失衡，使I型、III型膠原合成增多，弱化MMP-1對細胞外基質(zhì)（ECM）的降解作用，而ECM作為一種大分子物質(zhì)，當骨骼肌纖維受損時，可由細胞內(nèi)分泌到細胞外間質(zhì)中，在骨骼肌纖維的連接中承擔橋梁作用。ECM的大量外溢、增生、取代正常骨骼肌細胞可視為骨骼肌纖維化的重要標志[14]，因此可以推斷，嚴重鈍挫傷造成的受損部位肌肉組織中MMP-1/TIMP-1比值下調(diào)，是造成本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠腓腸肌組織纖維化的重要因素。在其他學者的研究中，也發(fā)現(xiàn)了類似趨勢[15]。楊寧等[16]研究發(fā)現(xiàn)，拉傷誘導(dǎo)骨骼肌纖維化模型大鼠腓腸肌組織的MMP-1/TIMP-1蛋白比值較正常組明顯下降；Lv S研究發(fā)現(xiàn)，主動脈狹窄誘導(dǎo)心肌纖維化模型大鼠心肌組織的MMP-1/TIMP-1平衡受到破壞[17]；李潔等研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化小鼠肝組織MMP-1顯著降低，TIMP-1顯著升高[18]。由此可見，MMP-1/TIMP-1的失衡是引起骨骼肌纖維化的重要分子基礎(chǔ)。

推拿治療直接作用于受損骨骼肌，可活血化瘀、理筋復(fù)脈、調(diào)理經(jīng)絡(luò)，對于急性骨骼肌損傷后再生具有明顯的效果[19-21]，而按摩時機與力度的選擇也是影響干預(yù)效果的重要因素，在急性損傷期由于損傷的肌纖維破裂、壞死、和炎癥細胞的浸潤，不宜立即施術(shù)，故本實驗按摩干預(yù)選擇在大鼠成模3 d后，為急性損傷中期，此時期受損腓腸肌炎癥反應(yīng)加劇，成纖維細胞增多，新生的毛細血管與肉芽組織正在形成，推拿可有效改善局部血液循環(huán)，促進淤血的吸收與壞死組織的清除，并可避免損傷組織的肌肉粘連，能有效的促進損傷肌肉的修復(fù)。而在推拿力度的選擇上，本實驗通過推拿手法測定儀的前期手法訓練，對王金貴教授手法進行復(fù)刻，通過按揉法降低受損部位淤結(jié)、腫脹，垂直用力，對受損肌纖維施以垂直按壓，在早期施以小強度按摩，于后期加大按摩力度，從實驗結(jié)果來看取得了較好的效果。在本實驗中，通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)按揉法干預(yù)，治療組大鼠腓腸肌纖維排列較整齊且間隙小、膠原纖維沉積降低、ECM增生減少、纖維化程度明顯降低。而qPCR和Western Blot結(jié)果顯示經(jīng)按揉法干預(yù)后大鼠腓腸肌MMP-1的表達及MMP-1/TIMP-1比值明顯上調(diào)，TIMP-1的表達明顯下調(diào)從而抑制了骨骼肌纖維化的形成。而其他學者的研究也表明推拿可促進肌纖維再生及肌衛(wèi)星細胞增殖，改善損傷區(qū)血液循環(huán)等加速骨骼肌損傷后修復(fù)[22-24]。由此推論，推拿可能是因為使腓腸肌損傷部位發(fā)熱、促進其血液循環(huán)、增加血管容積、改善了腓腸肌受損部位微循環(huán)，使受損部位修復(fù)所需要的氧和營養(yǎng)物質(zhì)得到大量補充，并降低與周圍組織的粘連，使慢性炎癥反應(yīng)得到緩解，在提升MMP-1表達的同時，降低TIMP-1的表達，使MMP-1/TIMP-1比值提升，進一步提升了MMP-1降解I型和III型膠原的效果，進而抑制纖維化的發(fā)生。

4 小結(jié)

結(jié)合HE染色形態(tài)學觀察，本研究所采用的鈍挫傷造模方式明顯引起了部分肌纖維斷裂，肉眼可見形成大量結(jié)締組織。而通過qPCR及Western Blot結(jié)果分析，MMP-1mRNA及蛋白表達下調(diào)，TIMP-1mRNA及蛋白表達上調(diào)，MMP-1/TIMP-1比值下降，并引起受損部位腓腸肌出現(xiàn)明顯纖維化癥狀。而經(jīng)過推拿干預(yù)后，治療組大鼠受損部位腓腸肌肌纖維結(jié)構(gòu)、大小均一，結(jié)締組織生成降低，纖維化程度明顯降低。MMP-1mRNA及蛋白表達明顯上調(diào)，TIMP-1mRNA及蛋白表達明顯下調(diào)，提升了MMP-1/TIMP-1比值，推測推拿治療可能通過改變MMP-1與TIMP-1動態(tài)平衡，進而，有效降低I型和III型膠原纖維的增生，促進肌肉的修復(fù)，降低受損肌肉纖維化程度。

綜上所述，推測按摩通過提升MMP-1/TIMP-1比值，有效縮短肌纖維修復(fù)過程，這可能為推拿促進骨骼肌損傷修復(fù)，降低纖維化的機制之一。