不同產(chǎn)地南北柴胡中柴胡皂苷的含量測(cè)定*

郭泰麟，康廷國(guó)，張 慧

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116001）

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根[1]。原名茈胡，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。具有疏散退熱，疏肝解郁，升陽舉氣的功效。柴胡（B.chinense DC.）又名北柴胡，狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd.）又名南柴胡，市場(chǎng)上兩種柴胡均以商品名出現(xiàn)。柴胡皂苷為柴胡中的有效成分[2-7]，目前對(duì)于柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的研究較多[8-13]，但是對(duì)于同時(shí)測(cè)定柴胡皂苷 a、d、c、f 4 種成分進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道很少。不同產(chǎn)地柴胡中其含量相差較大，為了評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地的南北柴胡質(zhì)量的優(yōu)劣，文章采用紫外可見分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地南北柴胡中的總皂苷的含量，同時(shí)使用HPLCELSD（高效液相色譜法和蒸發(fā)光檢測(cè)器連用法）測(cè)定柴胡中柴胡皂苷a、d、c、f的含量，旨在為柴胡的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀，安捷倫G6240B蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；島津UV-1750紫外檢測(cè)器；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LFP-800T高速多功能粉碎機(jī)；JD200-3千分之一天平（沈陽龍騰電子有限公司）；Sartourius CP225D十萬分之一天平。

1.2 材料

1.2.1 試劑和藥品 甲醇，乙醇為色譜純（Merck KGaA，Germany），娃哈哈純凈水，硫酸、乙醇、磷酸（購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）等均為分析純；對(duì)二甲氨基苯甲醛；對(duì)照品柴胡皂苷a（批號(hào)：P03M9F50593）購自上海源葉生物科技有限公司，柴胡皂苷d（批號(hào)：PS101397）、柴胡皂苷c（批號(hào)：PS000193）、柴胡皂苷f（批號(hào)：PS000195）均購自成都普斯生物科技股份有限公司。

1.2.2 樣品的收集 北柴胡共24批（編號(hào)1-24），南柴胡共5批（編號(hào)25-29）。購自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張慧教授鑒定為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）及狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd.）的根，樣品信息見表1-2。

2 柴胡總皂苷的含量測(cè)定

2.1 對(duì)照品的制備 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c、柴胡皂苷f適量，精密稱定，分別置于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容。制成柴胡皂苷a 0.401 mg/mL、柴胡皂苷d 0.415 mg/mL、柴胡皂苷c 0.419 mg/mL、柴胡皂苷f 0.451 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品的制備 取本品粉末（過65目篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，向內(nèi)加入含10%濃氨試液的甲醇液25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理（功率250 W，頻率 40 kHz）40 min，濾過，使用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液和濾液合并，在60℃回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，使用甲醇定容至容量瓶刻度線，搖勻，得供試品溶液。

2.3 總皂苷檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 精密吸取對(duì)照品柴胡皂苷d溶液500 μL置于10 mL具塞試管中，向內(nèi)加入濃度為1%的對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL。在70℃的水浴中反應(yīng)10 min，放置至室溫。再加入磷酸4 mL并在70℃的水浴中反應(yīng)30 min。放置至室溫。將甲醇為作為空白對(duì)照。對(duì)溶液進(jìn)行掃描（400～800 nm），溶液在536 nm處有最大的吸收峰，所以將536 nm作為柴胡總皂苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 總皂苷的含量測(cè)定 精密吸取6號(hào)樣品500μL置于10 mL具塞試管中，向內(nèi)加入濃度為1%的對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5 mL。在70℃的水浴中反應(yīng)10 min，放置至室溫。再加入磷酸4 mL并在70℃的水浴中反應(yīng)30 min。放置至室溫。在536 nm下檢測(cè)吸光度。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)方法操作，同時(shí)以不加供試品的平行樣為空白。在紫外可見分光光度計(jì)上進(jìn)行掃描（400～800 nm），結(jié)果顯示，陰性液在536 nm處無紫外吸收，證明陰性液無干擾，方法專屬性良好。

2.5.2 線性范圍考察 精密吸取本節(jié)“2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液 200、400、600、800、1 000 μL，分別置于 10 mL具塞試管中，使用甲醇將試管內(nèi)溶液定容至1 mL，加入1%對(duì)二甲氨基苯甲醛的乙醇溶液0.5 mL，在70℃的水浴中反應(yīng)10 min，放置至室溫。再加入磷酸4 mL并在70℃的水浴中反應(yīng)30 min。將甲醇為作為空白對(duì)照，按紫外-可見分光光度測(cè)定法，在536 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)Y，以質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2.51X-0.048 6，r=0.999，在質(zhì)量為 0.08～0.40 mg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取柴胡6號(hào)樣品0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法分別于 0、2、4、6、8、12 h 間隔，對(duì)柴胡總皂苷吸光度進(jìn)行測(cè)定。柴胡總皂苷吸光度的RSD為1.10%，結(jié)果顯示，在12 h內(nèi)總皂苷的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取柴胡6號(hào)樣品0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法，測(cè)定柴胡總皂苷的吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算吸光度的RSD值。RSD為1.01%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

2.5.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取6份同樣的柴胡6號(hào)樣品各0.5 g，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法，測(cè)定柴胡總皂苷的吸光度，計(jì)算總皂苷吸光度的平均值，總皂苷吸光度平均值為0.522，RSD為1.50%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取6份同樣的柴胡6號(hào)樣品各0.25 g，分別加入柴胡皂苷d對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，該方法總皂苷的回收率在99.2%～103%之間，RSD=1.42%，符合相關(guān)規(guī)定。

2.5.7 樣品溶液的測(cè)定 取24批北柴胡、5批南柴胡樣品，每個(gè)批次0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法，計(jì)算各個(gè)批次南北柴胡中總皂苷的含量。結(jié)果見表3、表4。

3 4種單體成分的含量測(cè)定

3.1 色譜條件 TOSOH TSKgel ODS-100V色譜柱（4.6 mm×150 cm，5 μm）；乙腈（A）和水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～15 min：20%～30%A，15 min～20 min：30%～35%A，20 min～35min：35%～40%A，35 min～45 min：40%～50%A.VWD 檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速：1 mL/min，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20 μL。蒸發(fā)器溫度：30℃；霧化器溫度：40℃；氣體流速：1.6 mL/min。

3.2 樣品溶液的制備 取本品粉末（過65目篩）0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，向內(nèi)加入含10%濃氨試液的甲醇液25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）40 min，濾過，使用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液和濾液合并，在60℃旋蒸，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL棕色容量瓶，使用甲醇定容至容量瓶刻度線，搖勻，過0.45 μm濾膜，得供試品溶液。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取20 μL的供試品溶液，對(duì)照品溶液，陰性溶液，按照“3.1”項(xiàng)下方法，進(jìn)樣測(cè)定。從圖1可知，對(duì)照品和供試品溶液分離度均大于1.5，互不干擾，且陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 典型色譜圖

3.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷c、柴胡皂苷f對(duì)照品溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1 mL，置于 1 mL 容量瓶中，甲醇定容到刻度線，精密吸取各個(gè)稀釋之后的對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相中，檢測(cè)，以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)X，峰面積的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

3.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取柴胡6號(hào)樣品0.5 g，按“3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下方法分別于 0、2、4、6、8、12 h 間隔，對(duì)柴胡皂苷 a、d、c、f含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得含量的RSD為1.04%、2.07%，0.981%、2.61%，結(jié)果顯示，在12 h內(nèi)供試品的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

3.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取柴胡6號(hào)樣品0.5 g，按“3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下方法，測(cè)定柴胡皂苷 a、d、c、f含量，連續(xù)測(cè)定 6 次，計(jì)算RSD值分別為0.993%、1.93%、0.722%、1.65%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

3.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取6份同樣的柴胡6號(hào)樣品各0.5 g，分別按“3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下方法，計(jì)算柴胡皂苷 a、d、c、f含量，計(jì)算出RSD分別為1.70%、2.10%、0.863%、2.14%，說明該方法重復(fù)性良好。

3.3.6 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取6份同樣的柴胡6號(hào)樣品各0.25 g，分別加入適量柴胡皂苷a、d、c、f對(duì)照品，按“3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下方法，測(cè)定柴胡皂苷 a、d、c、f的含量，計(jì)算回收率，該方法計(jì)算出柴胡皂苷a、d、c、f含量的平均回收率分別為100%、100%、101%、101%，RSD分別為1.32%、1.19%、0.952%、0.851%，符合相關(guān)規(guī)定。

3.4 樣品的含量測(cè)定 取24批北柴胡、5批南柴胡每個(gè)批次0.5g，按“3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算各個(gè)批次南北柴胡中柴胡皂苷 a、d、c、f的含量。結(jié)果見表 3、表 4。

3.5 相關(guān)性分析 分別將南、北柴胡中總皂苷和4種單體成分輸入進(jìn)SPSS 24.0，進(jìn)行相關(guān)性分析。采用偏相關(guān)性分析方法，觀察P值。當(dāng)P＜0.05時(shí)，說明二者之間存在線性相關(guān)的關(guān)系；當(dāng)P＞0.05時(shí)，說明二者之間無線性相關(guān)的關(guān)系。

總皂苷與柴胡皂苷a、d、c、f含量之間P值分別為 0.394、0.178、0.519、0.117。從結(jié)果中可以得知，柴胡總皂苷的含量與4中單體皂苷之間不具有相關(guān)性，所以不僅要測(cè)定總皂苷的含量，還需要對(duì)柴胡皂苷a、d、c、f的含量進(jìn)行測(cè)定，才能對(duì)柴胡的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表3 北柴胡總皂苷及4種單體皂苷含量測(cè)定 %

表4 南柴胡總皂苷及4種單體皂苷含量測(cè)定 %

4 討論

4.1 指標(biāo)成分的選擇 在2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中，柴胡的含量測(cè)定指標(biāo)性成分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d兩種成分，但是通過前期對(duì)不同產(chǎn)地南北柴胡指紋圖譜的建立的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷c、柴胡皂苷f這兩種成分含量也較高，可以作為柴胡的指標(biāo)性成分，加之對(duì)照品易得且價(jià)格合理，所以本實(shí)驗(yàn)選取這4種成分作為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定。

4.2 含量測(cè)定的分析 2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中要求指標(biāo)性成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的總量不得少于0.30%，本實(shí)驗(yàn)中24批北柴胡和5批南柴胡中的兩種柴胡皂苷總含量均遠(yuǎn)高于此，其中北柴胡中含量最高的是來自四川阿壩州的北柴胡（S15），柴胡皂苷a、d總含量達(dá)到了2.02%，南柴胡中來自山東臨沂產(chǎn)的南柴胡（S27）含量最高，達(dá)到了2.29%。同時(shí)通過對(duì)不同產(chǎn)地的南北柴胡中柴胡皂苷 a、d、c、f的含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4 種成分含量均有明顯差異，表明多組分成分的測(cè)定對(duì)藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)是可行且有必要的。