基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討參附養(yǎng)心湯治療心力衰竭的作用機(jī)制

郭麗君，馬曉昌

1990年—2016 年，隨著人口增長(zhǎng)和老齡化，缺血性心臟病的年齡標(biāo)化死亡率仍在增加[1]。心力衰竭是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段，死亡率和再住院率居高不下[2]。容量負(fù)荷過(guò)重和瘀血癥狀是大多數(shù)急性失代償性心力衰竭(ADHF)病人住院的主要原因[3]。超濾作為一種替代療法，被推薦用于頑固性心力衰竭及利尿劑抵抗者[4]。前期研究顯示，血液超濾雖然能夠替代腎臟的一部分功能，但沒有腎氣的蒸化功能，不能將體內(nèi)水液升清降濁，因此，超濾液中不僅包括體內(nèi)潴留的水液，還包括正常的津液。機(jī)體內(nèi)陰液丟失，就會(huì)出現(xiàn)口舌干燥、渴喜飲水、脈細(xì)等陰虛證候。津液丟失過(guò)多，陰虛而陽(yáng)氣無(wú)所依附會(huì)出現(xiàn)陰陽(yáng)兩虛的表現(xiàn)[5]。血液超濾雖然能夠迅速解決病人的水停之癥，但造成了氣陰兩傷，甚至陽(yáng)氣耗損(統(tǒng)稱“正氣虧虛”)。益氣扶正類中藥(參附養(yǎng)心湯)是西苑醫(yī)院馬曉昌主任的經(jīng)驗(yàn)方，西苑醫(yī)院是最早開展血液超濾治療的醫(yī)院之一，長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)參附養(yǎng)心湯(人參、附子、黃芪、麥冬)聯(lián)合血液超濾能夠減少血液超濾治療心力衰竭時(shí)的不良反應(yīng)，降低不良事件發(fā)生率、再住院率[6-7]。在證實(shí)其臨床有效性和安全性的基礎(chǔ)上，目前對(duì)于益氣扶正類中藥參附養(yǎng)心湯的作用機(jī)制尚不明確，因此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)參附養(yǎng)心湯治療心力衰竭的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為今后的機(jī)制研究提供參考及理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件主要包括：中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、GeneCards(https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/)、OMIM(https：//www.omim.org/)、MalaCards(https：//www.malacards.org/)、TTD(https：//db.idrblab.org/ttd/)、Uniprot(https：//www.uni)、STRING(https：//string-db.org)、DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)、VENNY2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、STRING(https：//string-db.org)、DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)、易漢博生物信息在線作圖網(wǎng)站(http：//www.ehbio.com/ImageGP/)、Cytoscape3.7.1軟件和cytoHubba插件。

1.2 參附養(yǎng)心湯活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)尋找參附養(yǎng)心湯的主要活性成分及潛在靶點(diǎn)，依據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)ADME(吸收、分布、代謝及排泄)，本研究以口服生物利用度(OB)和藥物相似性(DL)作為藥物成分的篩選條件，以參附養(yǎng)心湯的人參、附子、黃芪、麥冬為關(guān)鍵詞，檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其成分及其作用的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選及構(gòu)建，篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18。查不到的成分應(yīng)用BATMAN-TCM[8]分析。將成分提交給BATMAN-TCM，以score cut off=20為篩選線，以P<0.05 作為“藥物-通路”結(jié)構(gòu)構(gòu)建的基準(zhǔn)，得到活性成分及靶點(diǎn)。

1.3 心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建 本研究以“heart failure”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards、OMIM、MalaCards、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)綜合篩選心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)檢索以上數(shù)據(jù)庫(kù)，去重后獲得心力衰竭基因靶點(diǎn)，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查詢靶點(diǎn)蛋白的基因名稱。

1.4 疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將參附養(yǎng)心湯潛在靶點(diǎn)與心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)均進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化命名(Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中的Gene name行標(biāo)準(zhǔn)化命名)，通過(guò)Excel表獲得參附養(yǎng)心湯-心力衰竭共同靶點(diǎn)。采用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、可視化分析等。根據(jù)Degree篩選出重要藥效靶點(diǎn)。

1.5 藥物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將參附養(yǎng)心湯-心力衰竭共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，將全節(jié)點(diǎn)關(guān)系信息導(dǎo)出并利用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建靶點(diǎn)-靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)Degree篩選出關(guān)鍵基因(Hub Gene)。

1.6 基因本體論(GO)及KEGG通路富集分析 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)包括分析工具和整合生物學(xué)相關(guān)知識(shí)的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以從海量的基因與蛋白簇中提取有價(jià)值的生物學(xué)信息，該數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行分析注釋從而可以構(gòu)建GO生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞組成(cellular components，CC)、分子功能(molecular function，MF)及KEGG通路富集結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 參附養(yǎng)心湯活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)OB與DL閾值，剔除重復(fù)化合物與缺少靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)的化合物，最終共得出40個(gè)活性成分，其中人參17個(gè)、附子6個(gè)、黃芪17個(gè)、麥冬0個(gè)，在 BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢索麥冬的作用靶點(diǎn)，篩選Score cut off≥20、P<0.05的活性成分，獲得17個(gè)藥物活性成分(見表1)。各中藥活性成分仍有重疊，刪除重復(fù)后得到55個(gè)活性成分。以S1-S55為序號(hào)對(duì)化合物成分進(jìn)行編碼。對(duì)55個(gè)化合物進(jìn)一步預(yù)測(cè)，初步獲得1 050個(gè)靶點(diǎn)，將相同的靶點(diǎn)進(jìn)行歸一，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)并轉(zhuǎn)換，最終共得到336個(gè)靶點(diǎn)。

表1 參附養(yǎng)心湯活性成分篩選

2.2 心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建及比對(duì)分析 以“heart failure”為關(guān)鍵詞在GeneCards、OMIM、MalaCards、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢，發(fā)現(xiàn)心力衰竭的藥物治療性靶點(diǎn)有GeneCards(1 539)、OMIM(25)、MalaCards(51)、TTD(42)，篩選GeneCards中相關(guān)度score>0的基因(527)，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)并轉(zhuǎn)換、刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到582個(gè)。

2.3 疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將參附養(yǎng)心湯靶點(diǎn)與心力衰竭靶點(diǎn)導(dǎo)入Excel表進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)心力衰竭與參附養(yǎng)心湯潛在靶點(diǎn)有49個(gè)重合，并于VENNY2.1中繪制韋恩圖(見圖1)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)表示化合物和靶標(biāo)，連線表示化合物與靶標(biāo)之間的相互作用。通過(guò)根據(jù)Degree篩選出排名前10 的重要藥效成分(見表2)。

注：藍(lán)色圓形為參附養(yǎng)心湯靶點(diǎn)集合；黃色圓形為心力衰竭靶點(diǎn)集合。圖1 參附養(yǎng)心湯與心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

注：綠色代表藥物成分，藍(lán)色代表參附養(yǎng)心湯-心力衰竭共同靶標(biāo)。圖2 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 參附養(yǎng)心湯治療心力衰竭的藥效成分(前10位)

2.4 靶點(diǎn)-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將參附養(yǎng)心湯-心力衰竭共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)中。利用Multiple proteins工具，限定物種為人，本研究設(shè)定置信度閾值≥0.7，隱藏網(wǎng)絡(luò)中不相關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)，對(duì)蛋白相互作用進(jìn)行篩選，獲取蛋白相互作用。結(jié)果共涉及49個(gè)節(jié)點(diǎn)，106條邊，平均節(jié)度點(diǎn)為4.33，平均局部聚類系數(shù)為0.535。線條的顏色代表連接的程度(見圖3)。將全節(jié)點(diǎn)關(guān)系信息導(dǎo)出并導(dǎo)入Cytoscape，利用cytoHubba插件根據(jù)Degree篩選出前10種PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因(見圖4)，并進(jìn)行柱狀圖可視化(見圖5)。

圖3 參附養(yǎng)心湯作用于心力衰竭潛在靶點(diǎn)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 前10種PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 前10種PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因柱狀圖

2.5 GO及KEGG通路富集分析 通過(guò)DAVID軟件對(duì)獲得的49個(gè)參附養(yǎng)心湯-心力衰竭共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，富集分析采用超幾何分布設(shè)計(jì)的算法，針對(duì)富集分析顯著性P值的多重檢驗(yàn)校正使用Benjamini-Hochberg 校正方法。GO 屬于基因功能分類體系，有3個(gè)分支，即生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組分，最終得到211個(gè)BP，29個(gè)CC，36個(gè)MF。生物過(guò)程包括：缺氧應(yīng)答、胰島素分泌調(diào)節(jié)、膽固醇代謝過(guò)程、血壓的負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)、血管收縮的正向調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、衰老、心肌肥大的正調(diào)控、血壓調(diào)節(jié)。細(xì)胞組成包括：細(xì)胞外間隙、線粒體、T型小管、細(xì)胞外區(qū)域、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高密度脂蛋白顆粒、質(zhì)膜等。分子功能包括：酶結(jié)合、電子載體活性、強(qiáng)直性結(jié)合、甾體結(jié)合、脂肪酰基-輔酶A結(jié)合、NADP結(jié)合、膽固醇結(jié)合、類固醇激素受體活性、氨基酰化酶活性。應(yīng)用Excel表根據(jù)Enrichment score[-log(PValue )]前10進(jìn)行柱狀圖可視化(見圖6)。

圖6 參附養(yǎng)心湯潛在靶點(diǎn)治療心力衰竭GO分析柱狀圖(前10位)

參附養(yǎng)心湯治療慢性心力衰竭主要富集的KEGG生物學(xué)通路有57條，主要包括腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號(hào)通路、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)通路、醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶(PKG)信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、toll樣受體信號(hào)通路、單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路、雷帕霉素受體蛋白(mTOR)信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、胰島素分泌等。通過(guò)易漢博生物信息在線作圖網(wǎng)站(http：//www.ehbio.com/ImageGP/)對(duì)KEGG信號(hào)富集分析前10結(jié)果進(jìn)行可視化處理(見圖7)。其中，X 軸代表富集因子(richfactor，即目標(biāo)基因中屬于這個(gè)分支的基因的數(shù)量/背景基因集中這個(gè)分支所有基因的數(shù)量)，Y 軸代表名稱，氣泡面積大小代表目標(biāo)基因集中屬于這個(gè)分支的基因數(shù)量，氣泡顏色代表富集顯著性，即P值的大小。

圖7 參附養(yǎng)心湯治療心力衰竭潛在靶點(diǎn)KEGG分析的氣泡圖(前10位)

3 討 論

過(guò)去的30年里，慢性心力衰竭病人的預(yù)后得到了明顯的改善，然而因急性心力衰竭(AHF)住院的病人仍然存在高不良事件風(fēng)險(xiǎn)[9]。對(duì)AHF病理生理學(xué)的進(jìn)一步了解為臨床醫(yī)生評(píng)估和管理AHF病人提供了一個(gè)框架，并強(qiáng)調(diào)了旨在改善臨床結(jié)果的未來(lái)治療目標(biāo)[10]。容量超負(fù)荷是急慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理生理過(guò)程。已有的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)推薦血液超濾用于有明顯容量超負(fù)荷且常規(guī)利尿劑治療效果不佳的心力衰竭病人[11]。然而，AVOID-HF[12]研究顯示，住院心力衰竭病人采用超濾治療與高劑量利尿劑治療相比，體質(zhì)量變化相當(dāng)，具有減少30 d和90 d心力衰竭再住院或心血管事件的趨勢(shì)，但未降低90 d死亡率，且局部不良并發(fā)癥更多。前期的研究也顯示，血液超濾治療后的病人普遍存在氣陰兩傷，甚至陽(yáng)氣耗損(統(tǒng)稱“正氣虧虛”)的表現(xiàn)，而血液超濾結(jié)合益氣扶正類中藥(參附養(yǎng)心湯)可以改善病人的癥狀，改善呼吸困難指數(shù)[7]。

參附養(yǎng)心湯由人參、附子、黃芪、麥冬組成。根據(jù)Degree值篩選出參附養(yǎng)心湯治療心力衰竭的主要有效成分存在于人參、黃芪、麥冬之中居多。方中人參具有大補(bǔ)元?dú)狻⒀a(bǔ)益肺脾、生津止渴、寧神益智的功效。黃芪乃補(bǔ)氣圣藥，能補(bǔ)一身之氣，兼有升陽(yáng)，固表止汗，利水消腫的作用。二者配伍，生曬參補(bǔ)而能守，生黃芪補(bǔ)而能行，二者使補(bǔ)而不滯。麥冬滋陰養(yǎng)心，故本方益氣養(yǎng)陰效果更佳，從側(cè)面驗(yàn)證了該方可以明顯改善超濾后病人的氣虛、陰虛癥狀。研究顯示參附養(yǎng)心湯的多個(gè)化合物可作用于同一個(gè)靶點(diǎn)，一個(gè)化合物也可以調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)，證實(shí)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)綜合觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥學(xué)結(jié)合研究，在中藥已知化學(xué)成分，疾病已知靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，充分利用已有的研究成果，將研究方式從“單靶點(diǎn)-單藥物”模式更新為“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)-多組分”模式，揭示“藥物-基因-疾病”共模關(guān)聯(lián)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)，參附養(yǎng)心湯治療心力衰竭可能的主要作用靶點(diǎn)是白細(xì)胞白介素-6(IL-6)。有研究顯示IL-6水平隨充血性心力衰竭的嚴(yán)重程度而增加，血漿中IL-6的增加主要與交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活有關(guān)。高水平的IL-6獨(dú)立于左心室射血分?jǐn)?shù)和血漿去甲腎上腺素，預(yù)測(cè)充血性心力衰竭病人的預(yù)后[13]。中和促炎細(xì)胞因子和抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路和隨后的基因表達(dá)是近期最有希望的治療策略之一[14]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和人類研究已經(jīng)證明了細(xì)胞因子的Janus性質(zhì)，要么是細(xì)胞保護(hù)作用，要么是有害的。它強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞因子作用的動(dòng)態(tài)方面，需要解決諸如濃度、產(chǎn)生時(shí)間和它們激活的受體類型等問(wèn)題。靶向控制激活心力衰竭的安全通路無(wú)疑是一個(gè)有效的治療目標(biāo)，但在考慮這一點(diǎn)之前，必須仔細(xì)描述慢性和急性心力衰竭中促炎細(xì)胞因子的精確動(dòng)力學(xué)和生物活性特征[15]。許多中藥具有雙向調(diào)節(jié)作用，該方是否能夠雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，使其達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡需要進(jìn)一步研究。

KEGG通路主要富集到TNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，TNF信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。然而，目前關(guān)于調(diào)節(jié)TNF治療心力衰竭的藥物臨床研究結(jié)果并不理想，如可溶性腫瘤壞死因子受體依那西普[16]和腫瘤壞死因子α(TNF-α)單克隆抗體英夫利昔單抗[17]。然而，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)靶向卡納金單抗確實(shí)能夠減少冠心病病人的炎癥標(biāo)志物和心血管事件[18]。參附養(yǎng)心湯調(diào)控心力衰竭的重要靶點(diǎn)有IL-6、MAPK、IL-1β，在今后的科研中可以研究這些靶點(diǎn)是否參與了參附養(yǎng)心湯對(duì)于心力衰竭的調(diào)控。有研究顯示TNF-α抑制β-腎上腺素能受體，導(dǎo)致交感神經(jīng)激素的反饋增加，進(jìn)而導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子TNF-α的前向升高，從而導(dǎo)致自我延續(xù)周期，而這種循環(huán)獨(dú)立于由損傷引起的促炎和抗炎反應(yīng)，導(dǎo)致有害的信號(hào)機(jī)制，引發(fā)心肌肥大、有害重構(gòu)和心力衰竭[19]。表明疾病的各種機(jī)制間相互作用，相互影響，對(duì)于疾病的治療不能著眼于單靶點(diǎn)、單通路，而應(yīng)該向多靶點(diǎn)、多途徑靠攏。本研究顯示參附養(yǎng)心湯不僅可以作用于TNF信號(hào)通路，還可以作用于心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號(hào)。

綜上所述，參附養(yǎng)心湯治療心力衰竭具有“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的作用特點(diǎn)，可為今后驗(yàn)證該藥具體作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路提供依據(jù)，減少資源的浪費(fèi)，也有助于該藥的二次開發(fā)。其主要生物學(xué)機(jī)制可能與以TNF為中心的信號(hào)通路有關(guān)。本研究尚存在一些局限，如有效成分相關(guān)靶點(diǎn)尋找和確認(rèn)方法需要進(jìn)一步優(yōu)化，在今后的研究中需要檢測(cè)參附養(yǎng)心湯的入血成分，進(jìn)而進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，使結(jié)果的可信程度更高。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討參附養(yǎng)心湯治療心力衰竭作用靶點(diǎn)尚屬預(yù)測(cè)，需要開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究這些靶點(diǎn)是否參與了參附養(yǎng)心湯對(duì)于心力衰竭的調(diào)控，對(duì)這些因子是上調(diào)還是下調(diào)，以及是否通過(guò)以TNF為中心的通路發(fā)揮作用。