心復力顆粒誘導缺氧無血清條件下H9C2心肌細胞自噬發揮抗凋亡作用的實驗研究

陸培培，郭彩霞，馬 杰，梁曉鵬，閆思雨，周憲梁，馬麗紅

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是全球最常見的死亡原因，已對人類健康構成嚴重威脅[1]。缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)是最常見的心血管疾病，其患病率約占心血管疾病的25%。2015年研究數據表明，全球高達900萬人死于IHD，使其成為致死率最高的疾病[2]。最新數據顯示，IHD在高收入國家患病率呈下降趨勢[3]，但在我國由于人口老齡化及城鎮化進程的加速和心血管病危險因素的流行，IHD患病率迅速增長，已躍居我國居民死亡原因的首位[4]。因此，尋找治療IHD的新藥物，降低其死亡率，具有重要的臨床意義。

細胞自噬是存在于真核生物細胞中的一種自我降解異常蛋白質和細胞器的生命活動，在細胞生存、分化和穩態維持中起到重要作用[5]。大量研究證實，細胞自噬參與調節缺血性心臟病的發生、發展和預后過程[1，6-7]，并與細胞凋亡途徑關系密切[8-9]。當心肌缺血時，心肌損傷的形式包括細胞凋亡、壞死和新近提出的自噬相關性細胞死亡[9]。故減少心肌細胞凋亡能保護缺血性心肌損傷，延緩甚至阻斷缺血后心力衰竭的發生。心復力顆粒(Xinfuli granules，XG)是施今墨傳人丁鳴九先生創制的用于治療心力衰竭的經驗方改良制劑。前期研究發現該藥能夠抑制心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡[10]，改善能量代謝[11]，抑制心肌梗死后心肌纖維化和心室重構[12]，但目前對其抑制心肌細胞凋亡和纖維化的機制仍不清楚，研究表明誘導缺血心肌細胞自噬可抑制凋亡，改善心功能[13-14]。因此，本研究擬采用缺氧無血清 (hypoxia/serum-deprivation，H/SD)條件培養大鼠H9C2心肌細胞，體外模擬心肌缺血，探討心復力顆粒對缺血心肌細胞凋亡和自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 大鼠心肌細胞H9C2購自上海拜力生物技術有限公司(ATCC)。

1.1.2 心復力顆粒溶液制備 心復力顆粒為我院內部制劑，由黃芪、人參、丹參、白芍、桂枝等組成，用水煎煮、真空濃縮、噴霧干燥、干式制粒，每包 5 g，含生藥量18.1 g。將上述顆粒溶于DMEM培養基后置于60 ℃水浴鍋中，超聲震蕩溶解，以3 000 r/min離心10 min后，再以孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，沉渣烘干用以計算藥物溶液濃度，DMEM培養基定容至濃度為2 mg/mL，分裝后于-20 ℃貯存備用。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養基、青霉素-鏈霉素雙抗及胎牛血清購自美國Gibco公司；細胞缺氧培養盒、厭氧發生袋、厭氧指示條均購自Mitsubishi Gas Chemical 公司；Western blotting 檢測中所用的一抗均購自CST公司，二抗購自中杉金橋公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將H9C2心肌細胞在含有10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/L鏈霉素的 DMEM培養基中進行培養，放置在 37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中，1～2 d 更換1次培養基，2～3 d 傳代1次。

1.2.2 實驗分組 ①藥物濃度梯度實驗：確定心復力顆粒保護心肌細胞的最適濃度，分為6組，分別為正常組(Normal)、缺氧無血清組(H/SD)、XG 100組(XG 100 μg/mL)、XG 200組(XG 200 μg/mL)、XG 400組(XG 400 μg/mL)、XG 800組(XG 800 μg/mL)。 ②抑制劑實驗：分為5組，分別為正常組(Normal)、缺氧無血清組(H/SD)、XG組(XG 400 μg/mL)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)組(3-MA 5 μmol/L)、XG+3-MA組(XG 400 μg/mL+3-MA 5 μmol/L)。

1.2.3 體外缺氧模型的建立 取對數生長期的細胞接種于6孔板中，每孔接種1.0×105個細胞，培養24 h，棄去培養液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗2次，加入適量DMEM無血清培養基，并按上述分組加入相應濃度的藥物處理。將細胞置于含厭氧指示條的缺氧盒中，放入厭氧袋，迅速關閉缺氧盒。將缺氧盒放在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中，繼續培養24 h。

1.2.4 Hoechst 33342熒光染色檢測細胞凋亡 取經過相應處理后的細胞，用4%的多聚甲醛在室溫下固定10 min，PBS洗滌2次，6孔板中每孔加入1 mL Hoechst 33342染液，室溫避光反應30 min。棄去染液，PBS洗滌2次后在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態并拍照。

1.2.5 MDC染色檢測細胞自噬 取經過相應處理后的細胞，在培養基中加入100 μmol/L單丹磺酰尸胺(MDC)染液，室溫避光反應30 min。棄去染液，PBS洗滌2次后加入適量含血清的培養基在熒光顯微鏡下觀察細胞自噬顆粒并拍照。

1.2.6 Western blotting檢測蛋白質表達水平 收取經過相應處理后的細胞，胞裂解液提取蛋白，蛋白質定量試劑盒(BCA)法測定蛋白濃度。以每孔30 μg總蛋白量上樣進行SDS-PAGE電泳，將電泳產物轉印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應濃度的一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后用相應的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育1 h，洗膜后曝光、顯影、定影。目的蛋白含量以β-actin作為內參，通過Quantity One軟件定量分析目的蛋白條帶。

2 結 果

2.1 心復力顆粒抑制缺氧無血清條件下H9C2細胞凋亡 各組細胞經過相應處理后，通過Hoechst 33342形態學和凋亡蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3檢測細胞凋亡。在倒置相差熒光顯微鏡下觀察發現，缺氧無血清組細胞形態明顯皺縮，大量細胞漂浮，貼壁細胞減少，而經過心復力顆粒處理的各組細胞皺縮及漂浮細胞數量均減少，貼壁細胞在數量上接近正常組，且具有一定的濃度依賴性，在藥物濃度為400 μg/mL時保護作用最強。如圖1所示，正常組細胞核大而均勻，呈現淡藍色；缺氧無血清組細胞核明顯固縮、碎裂，形態不規則；而心復力顆粒各濃度組細胞核形態變化隨著濃度增加而逐漸接近正常組，在XG400組的細胞核形態最接近正常組。

同時Western blotting結果顯示，缺氧無血清條件明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，促進凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達。心復力顆粒處理后，可顯著性抑制細胞凋亡，Bcl-2表達上調，Bax和Caspase-3的表達下調，且呈濃度依賴性，在XG400組作用最顯著，從而表明心復力顆粒可抑制缺氧無血清條件下H9C2 心肌細胞凋亡。詳見圖2。

注：箭頭指示凋亡細胞核。

注：內參為β-actin，各組實驗至少重復3次。與Normal比較，*P<0.05,# P <0.01;與H/SD 比較,△P <0.01。

圖2 各組Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白的表達水平比較

2.2 心復力顆粒誘導H/SD條件下H9C2細胞自噬 MDC染色可顯示自噬過程中自噬小體的形成，是檢測細胞自噬的有效方法。如圖3所示，與正常組比較，缺氧無血清組自噬小體明顯減少，而在XG各濃度組中，隨著藥物濃度增加，自噬小體數量明顯增加，在XG400組最明顯。同時作為自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3-β(microtubule associated protein 1 light chain 3β，LC3)蛋白表達水平與MDC染色結果基本一致，如圖3所示，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ呈劑量依賴性增加，并在XG 400組表達水平達到峰值。

注:與Normal 比較,*P <0.05;與H/SD 比較,# P <0.05,△ P <0.01。

2.3 心復力顆粒通過誘導心肌細胞自噬而發揮抗凋亡作用 用自噬特異性抑制劑3-MA處理細胞后，與缺氧無血清組比較，細胞凋亡明顯增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著減少，而凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達呈上升趨勢。心復力顆粒400 μg/mL可削弱3-MA的促凋亡作用，上調Bcl-2和LC3的表達水平，下調Bax和Caspase-3的表達水平。結果表明心復力顆粒可以促進H9C2心肌細胞自噬而起到抑制凋亡的作用。詳見圖4。

注:內參為β-actin,各組實驗至少重復3 次。與H/SD 組比較,*P <0.05,# P <0.01;與3-MA 比較,△ P <0.05,☆ P <0.01。

3 討 論

IHD是由冠狀動脈血流和心肌之間供氧需求失衡而導致的心肌細胞缺氧，最終發生凋亡和壞死，引起心肌損傷。近年來大量研究證實細胞凋亡參與IHD過程，造成心肌細胞減少，心肌纖維化和心室重構，最終發展為心力衰竭[15-16]，因此減少缺血心肌發生細胞凋亡可以延緩甚至阻斷心力衰竭的發生。細胞凋亡過程涉及一系列基因的激活、表達和調控，其中最主要的成員包括Bcl家族和Caspase家族，其中Bcl-2作為凋亡抑制因子，其過表達抑制凋亡，Bax和Caspase-3作為凋亡促進因子，其過表達促進凋亡的發生[17-19]。

細胞自噬自20世紀50年代首次報道后，近20年來引起科學界的廣泛關注，其既存在于機體的生理過程中，又參與多種病理生理過程，如腫瘤、神經退行性病變以及衰老[5]。研究發現，細胞自噬在IHD的發生和發展中起著重要作用，多數證據支持，細胞自噬在IHD中作為一種保護性機制發揮心肌細胞的保護作用，可能成為臨床治療IHD的新靶點[20]。Foglio等[13]研究發現急性心肌梗死后心肌梗死區細胞自噬增強伴隨凋亡率減少，Bax/Bcl-2比值和Caspase-3活性下降。Zhong 等[21]研究表明誘導自噬可減少缺氧/再灌注條件下心肌細胞的凋亡，提高存活率，當用自噬抑制劑氯喹阻斷自噬后，該心肌保護作用也消失。但有研究發現在心肌缺氧/再灌注過程中，細胞自噬扮演著雙重角色，缺血期自噬增強促進心肌細胞存活，而當血流恢復后誘導自噬對心肌有損傷作用[22]。為了驗證自噬在缺氧心肌中的作用，本研究選用H9C2心肌細胞在缺氧無血清條件下培養用以模擬體內缺血環境，以驗證心復力顆粒對細胞凋亡和自噬的影響。

心復力顆粒由黃芪、人參、丹參、白芍、桂枝、葶藶子等組成，具有益氣溫陽、活血利水的功效。該復方在臨床應用50余年，在治療缺血后心力衰竭方面療效顯著。本課題組前期研究證實，心復力顆粒可改善異丙腎上腺素引起的大鼠心肌梗死和心室重構[23]，減輕心肌梗死后心肌纖維化[12]，保護缺血后心肌損傷。

本研究發現，與缺氧無血清組比較，心復力顆粒各組心肌細胞凋亡水平顯著下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達上調，促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達下降，同時，細胞自噬相關蛋白LC3表達明顯增強，且在心復力顆粒400 μg/mL時自噬水平達到高峰。采用自噬特異性抑制劑3-MA后，細胞凋亡增加，但該作用可被心復力顆粒削弱，表明心復力顆粒是通過誘導細胞自噬發揮抗凋亡作用。

本研究從細胞層面初步探討了心復力顆粒在缺血性心臟病發病機制中的抗凋亡作用與自噬的保護作用，并在缺氧無血清培養條件下的H9C2心肌細胞中證實心復力顆粒通過誘導細胞自噬發揮抗凋亡作用，從而起到保護心肌的作用。