補腎填精益髓法對腦出血模型大鼠神經保護作用及Notch-1蛋白表達的影響

張 毅，魏緒旺，許 康，張 昭，薛瑤瑤，范天祥

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后大量神經細胞凋亡是造成ICH后神經功能障礙的根本原因[1]。目前修復神經方面的藥物多為腦源性神經營養因子，只能保護未受損的神經細胞，缺少直接促進神經干細胞(neural stem cells，NSCs)增殖的藥物。研究證實，海馬區存在NSCs，ICH后海馬區域產生的新生神經元可以遷移到腦損傷區域，有效改善神經功能缺損[2]。而海馬區神經發生的過程主要包括NSCs的增殖、分化以及遷移，這一過程受到Notch信號的調控，Notch信號通路在腦損傷時被激活，參與ICH后的神經再生與修復過程[3]。補腎填精益髓方源于劉完素《黃帝素問宣明論方》中的地黃飲子，研究證實地黃飲子能夠促進NSCs增殖分化，并改善其神經功能[4-5]。因此，本實驗通過建立ICH大鼠模型，基于Notch信號通路灌服補腎填精益髓方，觀察ICH大鼠Bederson神經功能評分、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)/神經元核抗原(NeuN)陽性細胞數、Notch-1蛋白表達變化，探討補腎填精益髓法對ICH大鼠的神經保護作用及Notch-1蛋白表達的影響，明確其具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用健康SD大鼠126只，體重200～250 g，動物許可證號：SCXK，陜2017-003，購自西安交通大學實驗動物中心，飼養于陜西中醫藥大學藥學院實驗中心動物房，室溫度維持在22 ℃左右，室內濕度維持在30%～40%。

1.2 實驗藥物 10%水合氯醛(上海運佳黃埔制藥)、0.5%碘伏消毒液(規格為每瓶100 mL)、單唾酸神經節苷脂注射液(北京賽升藥業股份有限公司)、0.9%氯化鈉注射液(廣東艾希德藥業有限公司)、γ-分泌酶抑制劑(DAPT，武漢博士德生物工程有限公司)。補腎填精益髓方組成：熟地黃15 g，山茱萸15 g，肉蓯蓉10 g，巴戟天10 g，炮附子6 g，肉桂12 g，石斛12 g，麥冬12 g，石菖蒲10 g，遠志10 g，茯苓10 g，生姜3片，大棗5枚。由陜西中醫藥大學附屬醫院藥劑室提供，符合2015年版《中國藥典》規范，按人與動物體重劑量折算表進行濃縮，煎藥濃縮成生藥濃度為1.54 g/mL，4 ℃冰箱保存備用。

1.3 實驗試劑 Anti-β-catenin抗體(ABCAM公司)、多聚體抗兔IgG-HRP(ABCAM公司)、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、Notch-1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、BrdU抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、Anti-NeuN Antibody(武漢博士德生物工程有限公司)、正常山羊血清(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 實驗儀器 轉輪式切片機(深圳永年科技公司)，TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(儀征市康福醫療器材有限公司)、BMJ-Ⅲ型包埋機(上海珂淮儀器有限公司)，PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(型號：XLCU-PHY-Ⅲ庫號)，數碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業集團有限公司)，圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0(美國Media Cybernetics公司)。

1.5 方法

1.5.1 ICH大鼠動物模型的建立 參考韓佳煒等[6]ICH大鼠模型制作技巧，采用自體尾動脈血注血法制作ICH模型。用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔麻醉大鼠，仰臥固定在立體定位儀上，使大鼠的前后囟處于同一水平；沿頭皮正中切一長約10 mm切口，參照大鼠立體定位圖譜，定位前囟前0.2 mm，中線右偏3 mm，微量注射器垂直進針約5.5 mm，到達右側大鼠尾殼核區，小型牙科鉆顱骨穿透至硬腦膜處；尾動脈抽取非肝素抗凝自體動脈血進針至尾狀核區，緩慢注入50 μL，2 min內勻速注入，緩慢將注射器完全退出，局部醫用骨蠟封閉，皮膚縫合，尾部切口加壓包扎，創傷處用碘伏消毒，并噴以青霉素以防感染。假手術組只做刺入動作，不穿透硬腦膜，不向腦內注血，余同對照組。

1.5.2 分組及給藥方法 取造模成功大鼠120只，隨機分為假手術組、模型組、神經節苷脂組、補腎填精益髓組、DAPT組，另設空白組6只，作為參照，總共126只。各組均于造模后次日灌胃。補腎填精益髓組：以補腎填精益髓方湯劑按1.54 mL/(kg·d)灌胃，每日2次，連續給藥28 d；神經節苷脂組：按30 mg/(kg·d)給予神經節苷脂注射液；模型組、假手術組：給予等體積無菌蒸餾水，自由飲食、活動； DAPT組：造模成功后，腹腔注射DAPT 10 mg/(kg·d)。各組分別在第3天、第7天、第14天、第28天4個時間點處死大鼠，在處死大鼠前24 h，腹腔注射BrdU 50 mg/(kg·d)，之后處死動物取材。

1.5.3 切片制作、尼氏染色、免疫組化檢測 于造模后第3天、第7天、第14天、第28天將每組BrdU標記的6只大鼠進行處死，4%多聚甲醛灌注取腦，冰凍切片機連續冠狀切片，切片厚18 μm。取大腦左側海馬組織平面，胰蛋白酶修復15 min，2 mol/L的HCl 37 ℃孵育30 min，5%羊血清室溫封閉30 min，加入Rabbi Anti-NeuN antibody(1∶100)，Rabbit Anti-Neun antibody(1∶100)，4 ℃冰箱孵育過夜，復溫30 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗5 min×3次，免疫組化檢測嚴格按照試劑盒說明操作，每張切片隨機選取海馬區5個400倍高倍鏡視野，NeuN共染色雙標陽性細胞，代表了新生NSCs，記錄BrdU/NeuN陽性細胞數。

1.5.4 Bederson神經功能評分及Notch-1蛋白表達 分別在造模成功后第3天、第7天、第14天、第28天進行Bederson神經功能評分[7]，采用Werstern Bcot法測定Notch-1蛋白表達。

2 結 果

2.1 病理學改變 模型組細胞壞死程度最嚴重，可見大部分細胞壞死、溶解、核濃縮，壞死細胞融合，邊界不清；補腎填精益髓組、神經節苷脂組較模型組、DAPT組細胞壞死程度輕，神經節苷脂組可見部分細胞核固縮，少量細胞核溶解，胞質液化，邊界較模糊；補腎填精益髓組細胞核完整，胞質淡染，核仁清晰，細胞與間質界限清楚。詳見圖1。

注：①為假手術組；②為模型組第7天；③為模型組第14天；④為神經節苷脂組第7天；⑤為神經節苷脂組第14天；⑥為補腎填精益髓組第7天；⑦為補腎填精益髓組第14天；⑧為DAPT組第7天；⑨為DAPT組第14天。各用藥組在第7天、第14天最典型，所以切片圖取第7天、第14天結果。

2.2 BrdU/NeuN雙標陽性細胞數比較 術后各時間點，模型組、假手術組、DAPT組大鼠海馬區均可見BrdU/NeuN雙標陽性細胞表達，但組間差異無統計學意義(P>0.05)。術后第7天、第14天、第28天，補腎填精益髓組BrdU/NeuN雙標陽性細胞數均高于假手術組、模型組、神經節苷脂組和DAPT組(P<0.01)；神經節苷脂組BrdU/NeuN雙標陽性細胞數均高于模型組和DAPT組(P<0.01)，低于假手術組(P>0.05)；而在術后第7天、第14天，補腎填精益髓組BrdU/NeuN 雙標陽性細胞數高于神經節苷脂組，且達到高峰(P<0.01)，隨后均呈下降趨勢。詳見圖2、表1。

注：①為假手術組；②為模型組第7天；③為模型組第14天；④為神經節苷脂組第7天；⑤為神經節苷脂組第14天；⑥為補腎填精益髓組第7天；⑦為補腎填精益髓組第14天；⑧為DAPT組第7天；⑨為DAPT組第14天。各用藥組在第7天、第14天最典型，所以切片圖取第7天、第14天結果。

表1 各組ICH大鼠海馬區BrdU/Neun表達(±s)

與假手術組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與DAPT組比較，③P<0.01；與神經節苷脂組比較，④P<0.01；與同組第3天時比較，⑤P<0.01。

2.3 Bederson神經功能評分 假手術組各時間點Bederson神經功能評分均為0分；DAPT組各時間點Bederson神經功能評分比較差異均無統計學意義(P>0.05)；模型組在第14天、第28天Bederson神經功能評分低于第3天、第7天，差異均有統計學意義(P<0.01)；術后第7天、第14天、第28天，補腎填精益髓組、神經節苷脂組Bederson評分均低于第3天，差異均有統計學意義(P<0.01)。術后第7天、第14天，補腎填精益髓組大鼠Bederson神經功能評分較模型組、神經節苷脂組、DAPT組改善明顯(P<0.01)，至術后第28天Bederson神經功能評分基本降至正常。詳見表2。

表2 各組Bederson神經功能評分比較(±s) 單位：分

與模型組比較，①P<0.01；與DAPT組比較，②P<0.01；與神經節苷脂組比較，③P<0.01；與同組第3天時比較，④P<0.01；與同組第7天時比較，⑤P<0.01。

2.4 各組大鼠海馬區出血灶周圍Notch-1蛋白表達 術后各時間，模型組、假手術組、DAPT組大鼠海馬區均可見Notch-1蛋白表達，但組間差異無統計學意義(P>0.05)。術后第7天、第14天、第28天，補腎填精益髓組、神經節苷脂組、DAPT組Notch-1蛋白表達均高于模型組和假手術組(P<0.01)；而在術后第7天、第14天，補腎填精益髓組Notch-1蛋白表達高于神經節苷脂組，且達到高峰(P<0.01)，隨后均呈下降趨勢。詳見表3、圖3。

表3 各組大鼠海馬區出血灶周圍Notch-1蛋白表達(±s)

與假手術組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與DAPT組比較，③P<0.01；與神經節苷脂組比較，④P<0.01；與同組第3天時比較，⑤P<0.01。

圖3 ICH大鼠海馬區Notch-1蛋白表達

3 討 論

ICH后大量神經細胞受損帶來神經功能缺損和病人死亡，給病人家庭及社會帶來了沉重負擔。如何減輕出血后繼發性腦損害是ICH治療的根本。目前出血性腦卒中主要的病理損害為血腫灶周圍凝血酶原釋放大量的炎性因子引起腦組織腫脹，導致繼發性神經元損傷[8]。因此，ICH的治療重點在于促進血腫吸收、降低血腫灶周圍的炎性水平、降低神經細胞損傷、恢復腦功能。在治療過程中如何恢復大腦神經元和最大限度地挽救腦細胞，恢復腦組織功能是目前研究的重點。

Notch信號通路首次由Ronald從胎鼠中提取出了NSCs，后來被證實可以調控NSCs的增殖與分化，Notch主要表達在胚胎期和成年期小鼠大腦的海馬區和室管膜區。研究提示，當活化Notch信號后，可以有效地促進小鼠海馬NSCs的增殖。而當Notch信號被外界因素干預受到抑制后，海馬中的NSCs數量明顯會降低[9]。在正常生理狀態下，Notch信號通路靶基因Notch蛋白始終恒定在相對穩定的表達水平，維持NSCs的數量。在病理環境下(如衰老、腦卒中、腦損傷)均會影響Notch的表達水平，進而影響NSCs的數量和海馬神經發生[10]。Notch主要是通過調控NSCs的分裂方式來決定NSCs的命運。當Notch信號通路下端NICD的靶基因Notch-1蛋白過表達，NSCs水平分裂的能力也明顯增高，促進機體組織內的NSCs數量保持穩定和促進新的NSCs產生[11]。DAPT是Notch信號通路抑制劑，研究證實當DAPT抑制了Notch信號通路后損傷灶周誘導的Notch1和Hes1表達以及細胞增殖顯著下降，ICH灶周圍NSCs增殖明顯減少，神經損傷癥狀改善不明顯[12]。

補腎填精益髓方源于地黃飲子，屬于滋補腎陰、補腎助陽開竅化痰之劑，對中風舌強喑痱、肢體偏癱、痰多難咳具有很好的效果。古代醫家劉完素認為中風之喑痱證主要是因腎精不足、腎氣虧損之足廢不能用，喑痱不能言。此方從古至今一直是治療中風之名方，已取得了較好的臨床效果。前期研究表明，地黃飲子不但可以改善大鼠記憶力、延緩衰老、抑制氧化損傷，保護神經功能，而且可以促進NSCs增殖，特別是在治療中風、阿爾茨海默病方面具有很好的臨床效果[4]?，F代藥理學研究表明，熟地黃、肉蓯蓉、巴戟天等提取物均有抗氧化、延緩衰老、改善記憶力、保護神經細胞等作用，其作用機制為通過提高病理組織區域的BDNF的表達，抑制Bax的過表達和降低Bcl-2表達，保護神經細胞，減少神經細胞凋亡[13-14]。

本實驗研究結果顯示，在預定的時間段給予補腎填精益髓方灌胃，能提高大鼠ICH灶周圍NSCs的數量。第7天、第14天時，NSCs數量達到高峰，隨后呈下降趨勢。其中補腎填精益髓組NSCs數量增加最明顯；補腎填精益髓組NSCs數量高于神經節苷脂組。各組各時間點均可見Notch-1蛋白表達，補腎填精益髓組和神經節苷脂組Notch-1蛋白表達增加最顯著；且補腎填精益髓組較神經節苷脂組Notch-1蛋白表達更顯著。從病理結果來看，補腎填精益髓組、神經節苷脂組細胞壞死程度較模型組、DAPT組輕，神經節苷脂組可見部分細胞核固縮，少量細胞核溶解，胞質液化，邊界較模糊；補腎填精益髓組細胞核完整，胞質淡染，核仁清晰，細胞與間質界限清楚。說明補腎填精益髓法促進ICH大鼠內源性NSCs增殖并可以改善ICH大鼠神經功能，其機制可能與Notch信號通路調控其下游靶基因Notch-1蛋白上調有關。本實驗通過DAPT抑制Notch信號通路后NSCs及Notch-1蛋白表達不顯著，且BrdU/Neun陽性細胞數增長均不顯著，通過對比DAPT組及神經節苷脂組進一步印證了補腎填精益髓法促進ICH大鼠內源性NSCs增殖，并且其促進NSCs增殖過程中有Notch信號通路介導。研究證實神經節苷脂可以促進外源性NSCs增殖分化，神經節苷脂可以有效保護腦神經，改善其神經功能缺損癥狀[15]。但從本實驗結果來看，神經節苷脂在促進內源性NSCs增殖分化方面并不顯著，但可以在一定程度上改善ICH大鼠神經功能，其作用機制還需進一步研究。

綜上所述，補腎填精益髓法能夠促進ICH大鼠神經細胞再生，其作用機制可能與補腎填精益髓方誘導Notch信號通路NICD下游靶基因Notch-1蛋白表達有關。