頭穴透刺對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力及海馬NR1、NR2B受體mRNA表達的影響

蔣凌飛 ，黃慶嘉，陳 煒，范郁山，趙彩嬌

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種神經系統退行性疾病，臨床特征以記憶障礙、失認、失用、人格、行為等改變為主，是癡呆最常見的一種類型。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體是離子型谷氨酸受體的一種亞型，在神經系統的發育、神經細胞存活、凋亡等多種生理過程發揮重要作用[1]。研究發現，NMDA受體與學習記憶障礙類疾病密切相關，在AD發病的眾多環節中起關鍵作用[2]。本實驗通過觀察頭穴透刺對AD模型大鼠學習記憶能力及大鼠海馬NR1、NR2B受體mRNA表達的影響，探討頭穴透刺治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取2月齡SPF級Wistar雄性大鼠60只，體質量(200±50)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供(動物生產許可證號：SCXK桂2009-0002)。

1.2 實驗藥品及試劑 焦碳酸二乙酯(DEPC)、Trizol試劑、2 000 bp DNA Marker試劑盒、TRIzol試劑盒，購于Invitrogen公司(美國)；鹽酸美金剛片(批號：H20120268，丹麥靈北藥廠生產)、鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)、10%水合氯醛等。

1.3 主要器材和設備 腦立體定位儀、Morris水迷宮實驗系統、無菌針灸針、普通聚合酶鏈式反應(PCR)儀、精密天平、pHS-3B/3C/2C/25性酸度計、Unico紫外光分光光度計、ABI7500熒光定量PCR、電針治療儀、光學顯微鏡等。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物造模 用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后，參照《大鼠腦立體定位圖譜》[3]，將大鼠固定于腦立體定位儀上，在前鹵后1.5 mm、矢狀縫側方1.5 mm處鉆孔，微量進樣器注射STZ 3 mg/kg，于手術的第1天和第3天分別兩次向側腦室注射[4]。

1.4.2 實驗分組及處理 60只Wistar大鼠，實驗第1天經水迷宮測試，排除先天愚笨者。隨機分為假手術組10只、空白組10只，剩余40只制備AD大鼠模型，造模14 d后，采用Morris水迷宮對大鼠模型進行篩選，選取AD造模大鼠30只，將AD模型大鼠隨機分為模型組、針刺組、西藥組，每組10只。造模20 d后進行治療，7 d為1個療程，連續治療4個療程，治療結束后，對各組大鼠再次進行Morris水迷宮測試。假手術組：按照動物造模方法將側腦室注射生理鹽水；空白組：常規飼養；模型組：常規造模；針刺組：俯臥位將大鼠固定在操作臺上，沿“神庭”至“上星”方向透刺雙側“百會”至“太陽”方向透刺，均沿皮刺入6 mm，7 d為1個療程，連續治療4個療程；西藥組：予鹽酸美金剛片10 mg/(kg·d)灌胃治療，7 d為1個療程，連續治療4個療程。

1.4.3 灌注取材 用體積分數10%水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔注射麻醉大鼠后，固定在手術臺上，快速開胸暴露心臟。用粗針頭經左心室插入升主動脈，剪開右心耳，用0.9%氯化鈉液250 mL快速滴入，沖洗組織內血液，立即斷頭取腦，分離出海馬組織，放入液氮罐內保存。

1.5 檢測指標

1.5.1 大鼠記憶能力檢測 分別于造模前、造模后及治療后進行3次水迷宮測試，并記錄各組大鼠空間探索實驗跨越平臺的次數與定位航行試驗逃避潛伏期。

1.5.2 熒光定量PCR法檢測NR1、NR2B受體mRNA相對表達量 按照Trizol試劑 RNA提取法抽提各組海馬組織mRNA，按照操作說明進行轉錄，引物序列(5′→3′)：內參RNA β-actin，下游CCTGTGGCATCCATGAAACTAC，上游 GCTAGGAGCCAGGGCAGTAA；NR1，下游GGGCTTGCTCTACCACTCTT，上游GCTTTTGCAGCCGTGAAC；NR2B，下游GCTCCAAAGCCCCATCATT，上游AGGCACCGTGTCCGTATCC。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，PCR反應95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共45個循環。反應結束后，以β-actin的Ct值為內參，使用2-△△Ct相對定量計算公式計算NR1、NR2B受體相對mRNA表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠學習記憶能力比較

2.1.1 定位航行試驗逃避潛伏期實驗結果 造模前各組大鼠逃避潛伏期比較，差異無統計學意義(P>0.05)。造模后模型組、西藥組、針刺組逃避潛伏期較空白組、假手術組明顯延長，差異有統計學意義(P<0.05)。治療后，西藥組、針刺組逃避潛伏期較造模后縮短(P<0.05)，且與模型組、空白組、假手術組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組定位航行試驗逃避潛伏期比較(±s) 單位：s

與空白組同時間比較，①P<0.05；與假手術組同時間比較，②P<0.05；與模型組同時間比較，③P<0.05；與同組造模后比較，④P<0.05。

2.1.2 空間探索實驗跨越平臺次數結果 造模前各組大鼠跨越平臺次數比較，差異無統計學意義(P>0.05)。造模后模型組、西藥組、針刺組跨越平臺次數明顯減少，與空白組、假手術組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。經治療后，西藥組、針刺組跨越平臺次數較造模后增加(P<0.05)，且與模型組、空白組、假手術組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組空間探索實驗跨越平臺次數比較(±s) 單位：次

與空白組同時間比較，①P<0.05；與假手術組同時間比較，②P<0.05；與模型組同時間比較，③P<0.05；與同組造模后比較，④P<0.05。

2.2 各組大鼠海馬NR1、NR2B受體mRNA表達量比較 模型組NR1、NR2B受體mRNA表達較空白組、假手術組明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。針刺組、西藥組NR1、NR2B受體mRNA表達較模型組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，且針刺組NR1、NR2B受體mRNA表達量高于西藥組，差異均有統計學意義(P<0.05)。說明AD模型大鼠海馬NR1、NR2B受體mRNA表達量下降，而頭穴透刺可明顯上調NR1、NR2B受體mRNA表達量。詳見表3。

表3 各組海馬NR1、NR2B受體mRNA表達量比較(±s)

與空白組同時間比較，①P<0.05；與假手術組同時間比較，②P<0.05；與模型組同時間比較，③P<0.05；與西藥組比較，④P<0.05。

3 討 論

NMDA為一種離子型谷氨酸受體，主要分布在神經細胞的突觸后膜，在中樞神經系統的發育和神經系統疾病的發生中發揮著重要的作用[5]。NMDA受體是一種異聚體，由亞基NR1、NR2、NR3組成，其中NR1是構成離子通道的基本亞基，NR2是調節亞基，能增強NR1對興奮性氨基酸的反應[6]。NR2亞基中的NR2B亞型與神經元的記憶與學習能力、可塑性密切相關[7]。學習和記憶的神經生物學基礎是突觸可塑性，NMDA受體具有參與神經突出可塑性調節的生理功能，特別是對長時增強效應(LTP)具有重要的調節作用[1]。研究發現，降低大鼠海馬中NMDA受體磷酸化狀況，可使大鼠海馬LTP降低和學習記憶功能減低，導致AD的發生[8]。

阿爾茨海默病屬于中醫學“呆病”“善忘”等范疇，本病病機為髓海不足，神機失司，病位在腦，與心、腎等關系密切。腦為元神之府，與人的記憶能力密切相關，如《類證治裁》言：“腦為元神之府，精髓之海，實記性之所憑也，老人健忘者，腦髓漸空也”。因此，選取頭部穴位針刺具有治療神志疾病的功能，也符合針灸學中選穴的“近治作用”原則。有研究發現，頭穴針刺能夠改善大鼠學習記憶能力及提高大鼠記憶保持能力[9]。百會、太陽、神庭、上星均為頭部腧穴。百會透刺太陽穴區有百會、承靈、曲鬢、太陽等穴，貫穿督脈、足少陽膽經、足太陽膀胱經3條陽經，具有聯系多經的特點[10]。有研究表明，百會穴透太陽穴聯合鹽酸多奈哌齊片能夠有效治療輕度認知障礙[11]。神庭透上星穴為治療癡呆的頭部要穴[12]。神庭、上星均為督脈腧穴，督脈與腦系疾病密切相關，如《難經·二十八難》云：“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風府，入屬于腦。”神庭是督脈與足陽明胃經、足太陽膀胱經的交會穴，是治療神志類疾病的要穴，上星穴具有開竅益氣充腦的作用[13]。

本實驗通過觀察AD大鼠的學習記憶能力，發現模型組逃避潛伏期延長、跨越平臺次數減少，針刺組、西藥組均能夠縮短逃避潛伏期、增加跨越平臺的次數，說明頭穴透刺與鹽酸美金剛片均能夠明顯改善AD大鼠的學習記憶能力。通過對大鼠海馬NR1、NR2B受體mRNA表達量比較，發現模型組大鼠海馬NR1、NR2B受體mRNA表達量下降，而針刺組、西藥組均能夠提高AD大鼠海馬NR1、NR2B受體mRNA表達量，且針刺組優于西藥組。因此，頭穴透刺可以改善AD大鼠的學習記憶能力，可能與頭穴透刺能夠提高海馬NR1、NR2B受體mRNA表達量有關。