液相色譜技術在特種乳制品中摻入其他乳源的研究現狀

文/謝婷婷 黃子珍 曾慶坤 楊 攀 李 玲 黃 麗＊

（1 中國農業科學院廣西水牛研究所；2 廣西壯族自治區水牛乳質量與安全控制技術工程研究中心；3 廣西南寧市武鳴區市場檢驗檢測服務中心）

我國乳制品種類豐富，除了市面上常見的普通牛乳（包括荷斯坦牛乳、娟珊牛乳等），還有水牛乳、羊乳、驢乳、牦牛乳、馬乳、駝乳等特種乳。特種乳因為特種乳畜的養殖規模較小，產量相對稀少，但又具有獨特的活性成分和功能性特異蛋白，能夠增強人體免疫力和抵抗疾病能力，因此，價格較普通牛乳高出數倍，通常作為高端產品流通于市場。但特種乳與普通牛乳在外觀和味道上無明顯差別，普通消費者無法分辨，導致不法商販為了牟取暴利將不同種類乳混合摻假，尤其是發展較好的水牛乳、羊乳和駝乳，常見在其液態乳、奶酪、奶粉中摻入普通牛乳，再以高價賣出，嚴重損害了消費者的合法權益，擾亂了特種乳的市場。為了應對這一現象，采取嚴厲措施以及利用檢測技術來防范此類摻假行為是非常必要且有意義的。目前，對于不同種類乳混合摻假的鑒別，一般根據乳制品中所含組分，如蛋白質、脂肪、維生素和遺傳基因等的差異來建立檢測方法，其中以色譜技術為基礎的高效液相方法顯示出很多的優勢，其具有分離速度快、分辨率、精確度和靈敏度高，重復性好，易于操作等優點，在過去的幾年里，已成功地應用到了乳制品的定量檢測和摻假鑒別領域。本文綜述該技術在不同種類乳中摻假檢測的研究現狀。

1 液相色譜技術

液相色譜技術又稱高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），是一種快速、高效的檢測方法，其分離度和分辨率較高，能同時進行定量和定性分析[1]。HPLC包括高壓輸注系統、樣品引入系統、色譜分離系統和檢測器，能夠利用梯度控制器使得固定相與流動相多次交換，實現樣液中混合物的分離。主要檢測過程為將待測液輸送到樣品引入檢測裝置，使用高壓泵將流動相輸入柱中，樣器內液體逐漸流動進入色譜柱，實現待測物的分離，分離后組分依次進入檢測器，再通過檢測器發送信號獲取相關數據信息，實現檢測[2]。HPLC主要是依據不同種類乳的蛋白質分子構成和維生素結構不同實現摻假檢測，常用的色譜包括反相色譜（RPC）、離子交換色譜（IEC）、體積排阻色譜（SEC）和疏水相互作用色譜（HIC）。這幾種色譜對復雜樣品的分離能力存在差別，其中RPC最佳，IEC和HIC次之，SEC較前三者差。因此，RPC在乳蛋白質的分析研究中，較其他色譜法具有更高的分離能力，應用更廣泛[3]。

反相高效液相色譜（R e-versed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RPHPLC）是利用蛋白質的疏水特性差異進行分離。其固定相通常是將機械強度好的多孔微粒硅膠與含羥基鏈或苯基的硅烷化試劑反應，生成表面有烷基或苯基的非極性固定相，流動相為比固定相極性更強的溶劑[4]。蛋白質在固定相四圍形成高度有序的水相結構，在疏水作用下，蛋白質暴露于溶液的疏水表面逐漸變少，降低水相有序性而增加體系的熵，隨后，通過改變流動相的組分使得結合的蛋白質按照疏水性強弱逐漸洗脫到流動相中[5]。RP-HPLC已廣泛應用于蛋白質的分析，近年來在乳蛋白質的分離和純化方面起到了重要作用，也為特種乳摻假檢測提供了可靠支持。

表1 不同種類乳成分和能量[7]

2 不同種類乳的成分差異

不同種類乳成分和能量存在一定的差別（表1）。與普通牛乳相比，水牛乳、牦牛乳和綿羊乳的蛋白質和脂肪含量較高，乳糖含量較低，乳品質更佳。除此之外，特種乳中還具有獨特的活性成分，如羊乳富含短鏈脂肪酸，酪蛋白與乳清蛋白的比值更接近于人乳；馬乳的維生素C和牛磺酸的含量都高于普通牛乳；驢乳中的硒和維生素含量分別是普通牛乳的8 倍和5 倍；駝乳的不飽和脂肪酸和礦物質（鎂和鈣）含量也優于普通牛乳[6]。這些優勢使得特種乳在提高免疫力、抵抗疾病等功效方面優于普通牛乳。而液相色譜技術可以基于特種乳特異成分上的差異，識別乳制品中的摻假現象。

3 基于不同種類乳酪蛋白差異性摻假檢測

乳蛋白作為乳制品重要的營養指標，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，酪蛋白含量約為蛋白質總量的80.00%，主要以αs1-酪蛋白（αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）和κ-酪蛋白（κ-CN）為主，目前研究以酪蛋白為標記成分，借助液相色譜技術，獲得不錯的鑒偽效果，且以RP-HPLC應用較多。在不同種類乳中，由于品種和個體之間的差異，核酸序列中特殊基因的突變導致氨基酸序列的不同乳蛋白表現出基因多態性，可作為摻假的依據[8]。梁政洋等[9]根據水牛乳與荷斯坦牛乳存在的蛋白多態性差異，將在RP-HPLC中分離特征酪蛋白的峰面積作為評價指標，以αs1-CN指紋圖譜特征峰作為摻假標記，當荷斯坦牛乳摻入量至2.00%時可被檢測到，實現快速準確地分析水牛乳中摻入荷斯坦牛乳的情況。Veloso等[10]采用RP-HPLC分離從普通牛乳、綿羊乳和山羊乳混合乳制品中純化的酪蛋白，均可以從色譜圖顯著評價摻假情況，并且山羊乳中摻入普通牛乳的檢測下限可以達到5.00%，檢測結果與尿素-聚丙烯酰胺電泳（Urea-PAGE）一致，但定量分析更準確。Mayer等[11]利用IE-HPLC法分離普通牛乳、綿羊乳和山羊乳中的酪蛋白，根據樣品中αs1-酪蛋白和para-κ-酪蛋白峰面積的差異，可以鑒別摻假液態乳和奶酪。現代分析中，更多的強調多種分析技術的聯合應用，比如液相色譜-質譜聯用，液相的高分離效果結合質譜的高特異性和靈敏性，尤其是對蛋白質和肽的結構信息解析上的優越性，使得其在摻假乳制品檢測中具有較好的適用性。姜敏[12]采用液相色譜/線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜法（UPLC-Q Exactive）檢測4 種羊乳粉和5 種全脂乳粉中的特異肽段進行初步辨別是否摻假，再建立高低含量普通牛乳的標準曲線對已知摻假比例的牛羊乳粉混合物進行了定量檢測，方法相對標準偏差RSD值小于15.00%，實驗結果可靠，靈敏度高，可用于牛羊乳摻假的篩查和定量檢測。除了檢測方法的結合外，借助數據分析手段如指紋圖譜和化學計量法能夠進一步提高檢測的實用性和準確性。馬露[7]使用RP-HPLC分離和量化了奶牛、山羊、水牛及牦牛乳蛋白組分，并獲得特征圖譜，且通過主成分分析法（PCA）可較為明顯的區分不同種類乳。雷穎穎等[13]利用RP-HPLC獲得羊乳蛋白質的色譜信息，結合中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統和主成分分析法，研究山羊乳和綿羊乳的差異性，結果表明，以蛋白質作為特征性成分能夠反映出羊乳的乳源品類和質量信息，實現對乳源品質的鑒別。

4 基于不同種類乳中乳清蛋白差異性摻假檢測

乳清蛋白主要包括α-乳白蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-LG）、血清白蛋白（BSA）、乳鐵蛋白、免疫球蛋白和溶菌酶[10]。不同種類乳中乳清蛋白遺傳多態性不同，因此，在液相色譜儀中出峰時間有區別，能夠定性定量檢測不同種類乳的摻假情況，作為乳制品中是否摻假的特征蛋白而受到較多關注。Rodriguez等[14]運用HPLC分離奶牛乳、山羊乳和綿羊乳混合樣的液態乳及奶酪中乳清蛋白，結合主成分分析法定性檢測和偏最小二乘（PLS）校正模型確定摻假比例，綿羊乳、山羊乳和奶牛乳的檢出下限為3.92%、2.81%和1.47%，能夠高效、靈敏、可靠測定不同乳源。在多種乳清蛋白同時作為標記物的研究中，成希飛等[15]利用RP-HPLC分析了水牛乳與荷斯坦牛乳2 種主要乳清蛋白的差異性，發現在保留時間、含量和遺傳變異上都有顯著的差異性，兩者乳清蛋白α-LA均無變異體，但水牛乳的β-LG有3 個變異體，而荷斯坦牛乳的β-LG有2 個變異體。分析是由于兩種乳源在蛋白質的一級結構上有所不同，從而造成蛋白在高級結構、分子量、所帶電荷及蛋白極性等方面不同，在進行梯度洗脫時，蛋白質隨洗脫液的疏水性的改變而逐步被洗脫，從而出峰時間有差異。Romero等[16]采用RP-HPLC分離普通奶牛乳、綿羊乳和山羊乳及其二元混合物的主要乳清蛋白BSA、α-LA和β-LG，通過保留時間差異能夠定性區分3 種乳源的乳清蛋白，同時發現奶牛乳的添加比例與其α-LA及β-LG峰面積之和成線性關系，能夠定量檢測羊乳中奶牛乳的摻假量，檢出限為1.00%，但無法定量識別綿羊乳中摻入山羊乳的情況。也有學者以單一乳清蛋白為標記物構建摻假檢測方法。Christoph等[17]以乳清中的β-LG為標記物，基于普通牛乳中的兩種β-LG蛋白（A和B）以及水牛乳的β-LG在氨基酸序列上的差異，采用液相色譜-質譜（HPLC-MS）聯用的方法檢測水牛乳和奶酪中普通牛乳成分，從色譜分離和質譜分析兩個水平檢測出了混合乳中的不同來源β-LG的差異，有效的避免了假陰性問題。Chen等[18]以β-LG為分子標記，采用高效液相色譜-電噴霧質譜聯用技術（HPLC/ESI-MS）分離羊乳中奶牛乳摻假的乳清蛋白，從色譜圖上β-LG的保留時間和質譜的總離子流圖譜來鑒定摻雜物，通過外標法測定摻假量，檢出限為50.00%。Ferreira等[19]認為β-LG在奶酪成熟過程中不發生降解，可作為不同種類乳源的摻假標記物，研究了RP-HPLC分離普通牛乳、山羊乳、綿羊乳及其二元混合液態乳和奶酪中的β-LG，通過β-LG遺傳多態性色譜圖定性識別摻假，并認為二元摻假中摻加量與β-LG峰面積的比值成線性關系，能夠定量混合液態乳、新鮮奶酪和成熟奶酪中不同種類乳源成分的比例，以及評價乳制品的真實性，尤其可以保護原產地標記（PDO）奶酪。以β-LGA與β-LGB峰面積比值作為檢測定量摻假程度的研究也不少。杜晞等[20]利用RP-HPLC對水牛乳中摻入奶牛乳的混合樣乳清蛋白進行分離，發現β-LG與其他蛋白組分在30 min 內均獲得較好的分離，以β-LGA和β-LGB的峰面積比值確定檢出限為10.00%，靈敏度不如聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）的檢出限1.00%，但分離得到峰較少、檢測時短，重復性較好。但β-LG在乳源的加工過程中發生降解，從而導致二者比例的變化，引起測定結果不準確。Giuseppe等[21]采用RP-HPLC對水牛乳中摻入奶牛乳的鮮乳、馬蘇里拉奶酪和高溫滅菌乳的乳清蛋白進行分離，發現奶牛乳β-LG有A和B兩種基因型，水牛乳只有B基因型，可以從色譜圖上直觀判斷摻假情況，同時，以β-LGA和β-LGB的峰面積比值與摻假量建立回歸關系，經回歸分析后可矯正因加工過程中所引起的試驗偏差，檢出限為0.50%。

5 基于不同種類乳維生素差異性摻假檢測

部分動物（如水牛和羊）體內的β-胡蘿卜素在轉化酶作用下分解為維生素A，因此，其分泌的乳汁中β-胡蘿卜素含量極少或沒有，感官上呈純白色，而奶牛體內缺乏這種酶，分泌的乳汁中含有較高含量β-胡蘿卜素而呈淺黃色，可作為差異評判的特征性指標。國內學者李寶寶等[22]以β-胡蘿卜素的含量作為特征指標，采用HPLC追蹤測定泌乳期4—9月期純普通牛乳、純羊乳以及普通牛乳添加量0～100.00%的摻假乳中β-胡蘿卜素含量波動范圍，以此為數據庫構建檢測方法，該方法對β-胡蘿卜素的檢測限為0.31×10-2μg/mL，定量限為1.00×10-2μg/mL，能夠實現定量判定分析，且簡單快速，成本較低，適宜于乳品企業或收奶站在收奶時快速檢測。

6 小結

在歐洲許多國家通過法律來規定生產者需標注乳制品的乳源信息，而目前我國國家層面對特種乳制品的區別檢測未有統一標準，導致市場上特種乳制品品質良莠不齊，打著特種乳的招牌虛假宣傳的行為屢見不鮮，阻礙了我國特種乳制品的發展。為保護好優質特種乳制品的良好聲譽，打擊假冒偽劣不良行為，亟待建立相應摻假檢測標準方法。液相色譜技術分析乳制品特征組分上具有分析速度快，分離效果好，靈敏度高，檢測限低，高度自動化，準確性高等優勢，可進一步探索構建特種乳乳源的定性定量檢測方法，對乳制品的質量監測提供檢測保障。