黑苦蕎黃酮提取工藝及其膠囊制備研究

葛瑞宏，李鵬沖，王 永，王法云，王 慧

（1.上海交通大學醫學院公共衛生學院，上海市轉化醫學協同創新中心-食品安全與毒理學評價中心，上海 200025；2.河南省商業科學研究所有限責任公司，河南鄭州 450002）

0 引言

苦蕎麥（學名韃靼蕎麥） 屬于蓼科蕎麥屬，是一種獨特的藥食兩用的糧食作物，在歐亞很多國家具有多年食用歷史。近年來，由于其頗高的營養價值和藥用價值引起人們越來越多的關注[1-2]。苦蕎麥中富含蛋白質、膳食纖維、抗性淀粉、不飽和脂肪酸、必需氨基酸、維生素、礦物質等營養成分[3-5]，活性成分中富含人體不能合成的蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物[6-7]，并被認為是蘆丁、槲皮素的天然主要來源之一[8]。苦蕎又分為黑苦蕎和黃苦蕎，黑苦蕎中的蘆丁含量是黃苦蕎的3～5倍[9]。國內外大量試驗研究結果表明，苦蕎黃酮具有輔助降血糖功能，且黑苦蕎黃酮提取率明顯高于黃苦蕎。張月紅等人[10]通過體外試驗和體內試驗證明，苦蕎乙醇提取物可降低餐后血糖，可能與其抑制α-葡萄糖苷酶活性有關。劉薇芝等人[11]研究表明，苦蕎黃酮提取物可降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠血糖與血脂水平。鮑濤[12]研究結果顯示，苦蕎黃酮對db/db小鼠的糖耐量和胰島素耐量有顯著改善。徐玉潔[13]研究表明，苦蕎種子中性提取物可防治由鏈脲佐菌素誘導的Ⅱ型糖尿病。薛長勇[14]研究發現，苦蕎黃酮具有降低血糖及血脂的作用，其作用途徑可能是通過抑制糖苷酶、三酰甘油，激活過氧化物體增殖劑激活型受體γ和α而實現的。Dong Gi Lee等人[15]以db/db小鼠為試驗對象，評價苦蕎乙醇提取物的降血糖功能，結果表明，服用苦蕎乙醇提取物的降糖效果與口服蘆丁作用相似，具有降血糖功能。

以云南昭通山區黑苦蕎為原料，以苦蕎黃酮作為功效成分，研制黑苦蕎膠囊保健食品，開展功效成分黃酮提取工藝及產品劑型工藝研究，并對產品進行質量評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑苦蕎，上海極蕎生物科技有限公司提供；蘆丁標準品（≥98%，批號100080—201811），中國食品藥品檢定研究院提供；糊精、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、預膠化淀粉、硬脂酸鎂（藥用級），安徽山河藥用輔料有限公司提供；無水乙醇，NaNO2，Al（NO3）3，NaOH，CH3COOK，MgCl2，K2CO3，NaBr，NaCl，KCl，KNO3等（分析純），國藥試劑（上海）有限公司提供；膠囊殼、乙醇（食品級），上海泰坦科技股份有限公司提供。

DF1000型手提式高速中藥材粉碎機，江陰市丫勻機械制造有限公司產品；SXT-06型索氏提取器，上海洪紀儀器設備有限公司產品；AB135-S型電子分析天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司；Multiskan Spextrum型酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品；RE-2000B型旋轉蒸發器、DZF-6053型真空干燥箱、DHP-9082型電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；PL-810A型水分測試儀，上海品重檢測設備有限公司產品；JL-A3型粉體綜合特性測試儀，成都精新粉體測試設備有限公司產品；LB-2D型崩解儀，上海黃海藥檢儀器有限公司產品；THC-1型數顯溫濕度計，廣州樂享電子有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑苦蕎膠囊制備工藝流程

黑苦蕎→粉碎→乙醇回流提取→抽濾→真空濃縮→真空干燥→混合輔料→制?！z囊灌裝→成品。

1.2.2 操作要點

（1）原料處理。優選云南山區黑苦蕎原料，清洗后烘干，粉碎、過篩。

（2）黑苦蕎黃酮提取制備。準確稱取制備的黑苦蕎粉，按照一定料液比，使用乙醇溶液回流提取一定時間后，真空抽濾得苦蕎黃酮提取液。

（3）黑苦蕎黃酮粉制備。提取的黑苦蕎黃酮提取液真空濃縮后，60～80℃真空干燥至含水量低于6%，得到黑苦蕎黃酮粉。

（4）原輔料混合。以黑苦蕎黃酮粉為主要成分，按比例添加輔料，混合均勻。

（5）制粒、裝膠囊、包裝。將一定體積分數的乙醇作為潤濕劑加入到原料粉中進行制粒。

用40目篩網制成濕顆粒，取40～60目的顆粒灌裝膠囊、包裝。

1.2.3 指標測定

（1） 蘆丁標準曲線的制作。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定苦蕎乙醇提取液中黃酮類化合物含量，以蘆丁為標準品于波長510 nm處測吸光度[16]。蘆丁標準品100℃烘干至質量恒定后，用體積分數60%的乙醇配制成質量濃度0.625 mg/mL的標準品溶液。精確吸取該標準品 0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mL，置于25 mL具塞試管中，用60%乙醇定容至12.5 mL刻度，加入0.7 mL質量分數5%的NaNO2溶液，搖勻、靜置6 min，再加入質量分數10%的 Al（NO3）3溶液 0.7 mL，搖勻、放置 6 min，加質量分數4%的NaOH溶液2 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻、放置10 min后，以60%乙醇為空白對照，測定其在波長510 nm處的吸光度。以標準液質量濃度C（mg/mL） 為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程Y=10.789X+0.094 8，R2=0.999 2（質量濃度為 0.01～0.06 mg/mL）。

（2）總黃酮提取率測定。將苦蕎黃酮提取液定容后準確移取1 mL置于25 mL具塞試管，按照標準曲線制作的方法測定其在波長510 nm處的吸光度，總黃酮提取率按下式計算。

（3）吸濕率的測定。將底部盛有氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器置于25℃的恒溫培養箱內48 h，此時干燥器內的相對濕度為75%。在已恒質量的稱量瓶底部放入厚約2 mm的藥粉，準確稱量后置于上述玻璃干燥器內（稱量瓶蓋打開）25℃保存，定時（4，8，24，48，72，96，120 h） 稱量，按下式計算吸濕率，并以吸濕率為縱坐標，時間為橫坐標作圖[17]。

（4）休止角測定。使用綜合粉體測試儀測定粉體休止角，考查其流動性。讀出圓錐體的直徑和高度，計算出粉體的休止角（tgα=H/R），重復3次，取平均值[18]。以休止角來評價粉體的流動性，一般認為休止角大于40°時流動性不好，休止角小于40°時可直接充填[19]。

（5）顆粒成型率測定。顆粒成型率為整粒后粒度在40～60目的顆粒占總顆粒的比例。制得的40～60目大小的顆粒數量占總顆粒數比例低于20%者為成型性差；高于20%而低于50%者為成型性一般；高于50%者為成型性好[20]。

（6） 堆密度的測定。采用量筒法，精密稱取3份一定量的黑苦蕎降血糖顆粒，將其置于10 mL的量筒中，輕輕敲打量筒的外壁，使顆粒均勻填充于量筒中，讀出體積并計算顆粒的堆密度。

（7）臨界相對濕度的測定。膠囊內容物生產封裝過程中環境因素會直接影響產品的質量，在生產過程中相對濕度是主要的影響因素，對膠囊內容物通過平衡吸濕性試驗，繪制吸濕平衡曲線，得到顆粒的臨界相對濕度，具體操作步驟如下：

取膠囊的填充物料顆粒6份，分別置于已干燥恒質量的稱量瓶中，精密稱定；將稱量瓶在開蓋狀態下，分別置于底部盛有7種飽和溶液的玻璃干燥器中，于不同濕度的干燥器中在25℃的恒溫培養箱內放置96 h；取出稱量瓶加蓋精密稱定，計算顆粒的吸濕率；以吸濕率為縱坐標，相對濕度為橫坐標繪制曲線，分析得到顆粒的臨界相對濕度值，進而確定生產環境的相對濕度[22-24]。

（8）水分測定。取黑苦蕎膠囊適量，傾出內容物，混合均勻，取約1 g左右的顆粒置于快速水分測定儀中，測定內容物的水分，每批次樣品測定3次，連續測定3個批次的樣品。

（9）裝量差異[25]。取3批黑苦蕎膠囊，每批樣品10粒，精密稱定各膠囊的質量后，將內容物傾出，操作過程不得損壞膠囊殼，并用小刷將膠囊殼刷凈，精密稱定囊殼質量，計算出每粒內容物的裝量，并將每粒裝量與平均裝量比較。

（10） 崩解時限[25]。根據中國藥典（2015版） 膠囊劑崩解時限的測定方法，測定3批黑苦蕎膠囊的崩解時限，每批樣品取6粒，置于崩解儀中測定。

1.2.4 工藝優化試驗

先通過單因素試驗分別考查苦蕎粉粒徑、提取溶劑濃度、提取時間、提取溫度、料液比等因素對苦蕎總黃酮提取率的影響，再通過正交試驗確定最佳工藝條件。

（1）苦蕎粉粒徑對總黃酮提取率的影響?？嗍w粉碎后，分別過80，100，120，140，160目篩網，收集不同粒徑的苦蕎粉，在提取溫度80℃，料液比1∶30（g∶mL），提取時間2.5 h的條件下，使用70%乙醇回流提取黃酮，考查苦蕎粉粒徑對總黃酮提取率的影響。

（2）乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響。設置提取溫度80℃，料液比1∶30（g∶mL），提取時間2.5 h，分別用50%，60%，70%，80%，90%，100%體積分數的乙醇對苦蕎黃酮進行提取，考查不同乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響。

（3）料液比對總黃酮提取率的影響。設置提取溫度80℃，乙醇體積分數70%，提取時間2.5 h，料液比分別在 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL） 的條件下對苦蕎黃酮進行提取，考查不同料液比對總黃酮提取率的影響。

（4）提取時間對總黃酮提取率的影響。設置提取溫度80℃，乙醇體積分數70%，料液比1∶30（g∶mL），分別對苦蕎黃酮進行 1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h的提取，考查不同提取時間對總黃酮提取率的影響。

（5）提取溫度對總黃酮提取率的影響。設置料液比1∶30（g∶mL），乙醇體積分數70%，提取時間2.5 h，分別在50，60，70，80，90℃提取溫度條件下對苦蕎黃酮進行提取，考查提取溫度對總黃酮提取率的影響。

（6）苦蕎黃酮提取正交試驗。在單因素試驗基礎上，設計正交試驗。

苦蕎黃酮提取工藝正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 苦蕎黃酮提取工藝正交試驗因素與水平設計

（7）膠囊劑型中輔料的篩選?？嗍w黃酮粉吸濕性較強，直接填充膠囊會出現質量差異大、膠囊殼易脆裂等情況，影響產品的品質。為改善粉體的性質，可加入合適的輔料。輔料能一定程度上改善主藥的吸濕情況，防止吸潮[21]。試驗篩選微晶纖維素、糊精、預膠化淀粉、羧甲基纖維素鈉4種輔料，按照質量比1∶1與苦蕎黃酮粉混合后，測定各組樣品的吸濕率，通過比較確定適宜的輔料。

（8）輔料添加量的確定。將苦蕎黃酮粉與優選輔料分別按照質量比2.0∶1.0，1.5∶1.0，1.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0均勻混合，以吸濕率為指標，考查不同原輔料比例對吸濕率的影響，確定輔料適宜的添加量。

（9） 制粒工藝中潤濕劑考查。稱取6份苦蕎黃酮與輔料的混合粉，分別用75%，80%，85%，90%，95%，100%乙醇進行制粒，用40目篩網制成濕顆粒，并觀察制軟材及軟材過篩情況，于60℃真空干燥，再通過40目篩整粒，60目篩去細粉，收集顆粒稱量，計算顆粒成型率。

（10）黑苦蕎膠囊質量分析。在最優工藝條件下連續制備3批黑苦蕎膠囊樣品，進行水分含量、裝量差異、崩解時限的檢測與評價。

1.3 數據處理

采用正交設計助手ⅡV3.1統計分析軟件進行正交試驗結果分析，圖形制作采用Excel和Origin 8.0數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 乙醇回流法提取苦蕎黃酮工藝研究

2.1.1 苦蕎粉粒徑對總黃酮提取率的影響

苦蕎粉粒徑對總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 苦蕎粉粒徑對總黃酮提取率的影響

由圖1可知，苦蕎總黃酮提取率隨著粒徑的減小而增大，苦蕎粒徑從80目減小到100目，總黃酮提取率顯著增加（p＜0.05）?？赡苁怯捎诳嗍w粉碎后，顆粒粒度變小，單位質量藥材的總比表面積增大，促進溶劑的滲透及活性物質黃酮的提取速度，有利于提高提取效率[26]?？嗍w粒徑從100目增加到160目，總黃酮提取率變化不大，因此可將苦蕎粉粒徑控制在100目。

2.1.2 乙醇體積分數對總黃酮提取率影響

乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，結果表明當乙醇體積分數小于60%時，總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增加而升高，由于乙醇體積分數增大，其極性變小，有利于極性較小的黃酮類化合物的溶出，故得率呈上升趨勢[27]。乙醇體積分數為60%時，總黃酮提取率最高。當乙醇體積分數大于60%時，總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增加呈現下降趨勢，可能是由于一些醇溶性雜質、色素、親脂性成分的溶出量增加，與黃酮類化合物競爭乙醇，從而導致黃酮類化合物的得率降低[28]。因此，確定提取乙醇體積分數為60%。

2.1.3 料液比對總黃酮提取率的影響

料液比對總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響

由圖3可知，料液比大于1∶30時，總黃酮提取率隨著料液比的減少呈現上升趨勢；料液比為1∶30時，總黃酮提取率最高；料液比低于1∶30時，總黃酮提取率隨著料液比的降低呈現下降趨勢。料液比影響溶劑的極性，從而影響不同極性黃酮類的溶解性，同時能耗也隨著料液比的降低而增大[29]。因此，確定料液比為1∶30。

2.1.4 提取時間對總黃酮提取率的影響

提取時間對總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對總黃酮提取率的影響

由圖4可知，提取時間小于2.5 h時，總黃酮提取率隨著提取時間的增加而提高；提取時間2.5 h時，總黃酮提取率達最大值；提取時間超過2.5 h后，總黃酮提取率隨著提取時間增加呈現下降趨勢，原因可能是時間的增大有利于黃酮類物質的溶出，超過最佳提取時間后，部分黃酮類物質隨著加熱時間的延長而分解，導致得率下降[30-31]。因此，將提取時間確定為2.5 h。

2.1.5 提取溫度對總黃酮提取率的影響

提取溫度對總黃酮提取率的影響見圖5。

由圖5可知，總黃酮提取率隨著提取溫度的升高而增加，提取溫度從60℃增加到80℃，總黃酮提取率顯著增加（p＜0.05），在80℃時達到最高點。溫度繼續增加，總黃酮提取率變化不大。因此，確定提取溫度為80℃。

2.1.6 苦蕎乙醇回流提取正交試驗

圖5 提取溫度對總黃酮提取率的影響

苦蕎黃酮提取正交試驗結果見表2。

表2 苦蕎黃酮提取正交試驗結果

由表2的因素極差值大小可以看出，以總黃酮提取率為評價指標，影響苦蕎黃酮提取試驗因素的主次順序為 C＞B＞D＞A，最優條件組合是 A2B3C2D2。經過3次試驗得出平均總黃酮提取率為44.68±2.29 mg/g，高于正交試驗中A3B3C2D1最佳組合，因此最終確定A2B3C2D2為最優組合，即乙醇體積分數60%，料液比1∶35（g∶mL），提取時間150 min，提取溫度80℃。

苦蕎黃酮提取方差分析（α=0.05） 見表3。

表3 苦蕎黃酮提取方差分析（α=0.05）

由表3可知，因素B料液比和因素C提取時間的差異在α=0.05水平上都是顯著的。

2.2 黑苦蕎膠囊工藝研究

2.2.1 輔料的篩選

不同輔料對吸濕率的影響見圖6。

圖6 不同輔料對吸濕率的影響

由圖6可知，在24 h內，各種粉體的吸濕率隨著時間的增加迅速增加，24 h后吸濕率趨于相對穩定；輔料添加后能夠明顯降低苦蕎黃酮粉的吸濕率，以添加微晶纖維素的粉體吸濕率降低最多，120 h時間內吸濕率均低于9%，中國藥典規定膠囊劑的含水量不得超過9%。選擇微晶纖維素作為添加輔料。

2.2.2 輔料用量考查

將苦蕎黃酮粉與微晶纖維素按不同比例進行混合，考查不同原輔料比例對吸濕率的影響。

苦蕎黃酮粉與微晶纖維素不同質量比對吸濕率的影響見圖7。

圖7 苦蕎黃酮粉與微晶纖維素不同質量比對吸濕率的影響

由圖7可知，不同原輔料比例吸濕性呈現相似的規律，在24 h內，吸濕率隨著時間增加迅速升高，24 h后吸濕率趨于穩定?？嗍w黃酮粉與微晶纖維素質量比為1.0∶1.5和1.0∶2.0時吸濕率最低，然而二者質量比在1.5∶1.0時，吸濕率即低于9%，結合產品配方考慮，確定苦蕎黃酮粉與微晶纖維素質量比為1.5∶1.0。

2.2.3 制粒工藝

（1）粉體休止角測定。將苦蕎黃酮粉與微晶纖維素按優選質量比均勻混合，用綜合粉體測定儀進行休止角測定。

粉體休止角測定結果見表4。

表4 粉體休止角測定結果

由表4可知，休止角測定結果大于40°，說明粉體流動性不夠，通過制?？梢栽黾游锪系牧鲃有?，因此進行制粒工藝研究。

（2）制粒工藝中潤濕劑的確定。

潤濕劑對顆粒成型率的影響見表5。

表5 潤濕劑對顆粒成型率的影響

由表5可知，乙醇體積分數為85%時顆粒成型率最高；制粒過程中，當乙醇體積分數低于85%時，雖然容易制粒但是物料容易起團；乙醇體積分數高于85%時，雖然不易起團，但是制粒較困難；而當85%乙醇作為潤濕劑時物料容易制粒且不易起團，故采用85%乙醇作為潤濕劑用于顆粒制備。

（3）內容物休止角。取制粒后的內容物進行休止角的測定，平行測定3次。

膠囊內容物的休止角見表6。

表6 膠囊內容物的休止角

內容物的休止角均小于40°，表明其流動性符合膠囊的灌裝要求[19]。

（4）膠囊型號的考查。

顆粒堆密度測定結果見表7。

表7 顆粒堆密度測定結果

由表7可知，顆粒的堆密度為0.657 g/mL。前期研究表明，每天需服用的產品劑量為2.7 g，若分為2次服用，每次3粒，則每粒的質量為0.45 g，根據顆粒堆密度計算所需膠囊的體積為0.68 mL，故選用0號膠囊殼用于黑苦蕎降血糖顆粒的灌裝。

（5）臨界相對濕度的測定。以吸濕率為縱坐標，相對濕度為橫坐標做不同環境下吸濕率曲線圖，再作曲線的切線，其交點橫坐標即為臨界相對濕度。

臨界相對濕度的測定見表8，膠囊內容物的臨界相對濕度曲線見圖8。

從圖8可看出，該品的臨界相對濕度為67.85%，當相對濕度＜67.85%時，粉末的吸濕性不強，當相對濕度＞67.85%時，粉末吸濕性明顯增加，故生產環境相對濕度應控制在67.85%以下。

表8 臨界相對濕度的測定

圖8 膠囊內容物的臨界相對濕度曲線

2.3 黑苦蕎膠囊質量分析

2.3.1 水分

黑苦蕎膠囊水分含量測定見表9。

表9 黑苦蕎膠囊水分含量測定

由表9可知，3批樣品的水分含量分別為5.12%±0.29%，5.10%±0.48%，5.33%±0.29%，符合中國藥典（2015版） 膠囊劑中水分不得高于9%的質量要求[25]。

2.3.2 裝量差異

中國藥典（2015版） 中膠囊劑裝量差異要求，平均裝量或標示裝量0.30 g及0.30 g以上裝量差異限度為±7.5%。取3批黑苦蕎膠囊，每批樣品10粒，測定裝量差異。

黑苦蕎膠囊裝量差異見表10。

由表10可知，3批樣品均未超出裝量差異限度，符合2015版《中國藥典》的要求。

2.3.3 崩解時限

根據中國藥典（2015版）膠囊劑崩解時限的測定方法，測定3批黑苦蕎膠囊的崩解時限，每批樣品取6粒，置于崩解儀中測定[25]。結果顯示，3批樣品的崩解時限分別為6，7，6 min， 均符合中國藥典（2015版）膠囊劑崩解時限的質量要求。

3 結論

苦蕎黃酮具有輔助降血糖功能。以苦蕎黃酮作為功效成分，選用黃酮提取率較高的黑苦蕎為原料，制備膠囊保健食品，對制備工藝進行研究，并對產品質量進行檢測評價。

表10 黑苦蕎膠囊裝量差異

以總黃酮提取率為指標，對黑苦蕎黃酮的提取工藝進行優化，確定苦蕎粉粒徑100目，最優提取條件為乙醇體積分數60%，料液比1∶35（g∶mL），提取溫度80℃，提取時間150 min；膠囊劑型工藝研究中，為改善膠囊內容物的性質，篩選微晶纖維素作為輔料，并確定適宜添加量，苦蕎黃酮粉與微晶纖維素質量比1.5∶1。

為改善粉體的流動性，對粉體進行制粒，以顆粒成型率為評價指標篩選85%乙醇作為潤濕劑。制粒后顆粒休止角小于40°，流動性滿足生產要求；最后通過顆粒堆密度的測量，選定0號膠囊灌裝；通過臨界相對濕度的測定確定生產環境相對濕度控制在67.85%以下。

最后對黑苦蕎膠囊進行質量評價，3批樣品的水分含量未超過9.0%，裝量差異未超過±7.5%，崩解時限未超過30 min，均符合中國藥典規定。

在接下來的工作中，將開展黑苦蕎膠囊的功能學動物試驗研究，對其功能性進行檢測和評價。