多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在AML1/ETO陽性急性髓系白血病診斷中的應(yīng)用研究

江梅 ，郭海燕 ，聶益軍 ，呂小林 ，萬臘根 ，張長林

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，江西 南昌 330006）

AML1/ETO融合基因陽性的急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）占所有 AML 的 5%~10%[1-6]。2001年世界衛(wèi)生組織（WHO）將 t(8;21)(q22;q22),AML1/ETO融合基因陽性的AML列為獨(dú)立亞型,美國NCCN指南將此亞型歸為預(yù)后良好組，當(dāng)伴有c-KIT突變視為預(yù)后中危組[7]。而且也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道AML1/ETO融合基因陽性的AML完全緩解率高達(dá)96%~98%，5年總生存期接近70%，無病生存期超過35個(gè)月[8-11]。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multiparameter flow cytometry，MFCM）以其快速、高通量且對標(biāo)本要求低等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于血液腫瘤診斷、分型及預(yù)后判斷。鑒于此,本研究旨在探討MFCM在AML1/ETO融合基因陽性的AML診斷中的應(yīng)用價(jià)值以及分析AML1/ETO融合基因陽性患者的骨髓細(xì)胞免疫表型,為病人早期診斷、分型和預(yù)后分層提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例資料 2010年1月至2018年1月期間在我院收治初診的44例經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)或分子遺傳學(xué)檢測AML1/ETO陽性AML患者以及44例AML1/ETO陰性患者，其中男性54例，女性34例，中位年齡45（9~71）歲，所有患者均于治療前同時(shí)作骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MFCM、細(xì)胞遺傳學(xué)或分子遺傳學(xué)檢查。AML診斷參照世界衛(wèi)生組織WHO2016[12]。

1.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測 AML診斷及分型參照FAB標(biāo)準(zhǔn)[13]。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷AML-M2b(對應(yīng)WHO分型中的AML伴AML1/ETO)或提示AML1/ETO陽性患者的骨髓象主要特點(diǎn)為原始粒細(xì)胞及早幼粒細(xì)胞明顯增多,以異常中性中幼粒細(xì)胞為主，≥30%（NEC）,異常中性中幼粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是胞核與胞質(zhì)發(fā)育極不平衡,核染色質(zhì)細(xì)致疏松，核仁大而明顯，胞質(zhì)豐富，含多量細(xì)小粉紅色中性顆粒，呈彌散分布,常見空泡和雙層胞質(zhì)，內(nèi)胞質(zhì)量多，呈粉紅色，外胞質(zhì)量少，呈淺藍(lán)色，且呈偽足狀。

1.3 MFCM檢測 應(yīng)用Beckman coulter FC500流式細(xì)胞儀檢測骨髓細(xì)胞的免疫表型，檢測FITC標(biāo)記的 CD2，CD7，HLA-DR 和 cMPO，PE 標(biāo) 記 的CD13,CD19,CD117和 cCD79a，ECD標(biāo)記的 CD34,CD14原CD20,以及cCD3,PC5標(biāo)記的CD10,CD15,CD33以及 PC7標(biāo)記 CD45。每管至少分析 10000個(gè)細(xì)胞。陽性界值根據(jù)同型對照以及內(nèi)對照來設(shè)定，膜表面抗原陽性率大于20%判斷為陽性[14]，胞漿抗原陽性率大于10%判斷為陽性[15]。

1.4 細(xì)胞遺傳學(xué)檢測

1.4.1 染色體核型分析 取骨髓液2 ml,肝素抗凝，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)后按 (1～2)×106/ml進(jìn)行直接法和RPMI-1640培養(yǎng)液短期培養(yǎng)法制備染色體并采用G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析,分析至少20個(gè)分裂相細(xì)胞。染色體核型描述按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2005)》。

1.4.2 熒光原位雜交（FISH)檢測 AML1/ETO融合基因雙色雙融合探針 (DCDF)購自美國Vysis公司。按試劑盒提供的 FISH操作說明進(jìn)行樣本處理、變性、雜交后洗脫等操作,在日本 Olympus BX5 1熒光顯微鏡下通過三色濾光鏡觀察雜交信號，AML1/ETO融合基因陰性的細(xì)胞可見2紅與 2綠分離雜交信號(2R2G)，典型AML1/ETO融合基因陽性細(xì)胞為 1紅 1綠 2黃((1R1G2F)，每份樣本計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞,并記錄雜交信號及統(tǒng)計(jì)各信號的百分率。

1.5 分子遺傳學(xué)檢測 采用RT-PCR檢測AML1/ETO,取肝素抗凝骨髓,提取單個(gè)核細(xì)胞,提取RNA后進(jìn)行RT-PCR，具體方法見文獻(xiàn)[16]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理診斷性試驗(yàn)四格表資料分析。

2 結(jié)果

2.1 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測 44例AML1/ETO陽性患者中，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)FAB分型為AML-M5病人17例，AML-M2及AML-M2a病人15例，AMLM2b及提示AML1/ETO陽性 11例，AML-M4病人1例，各個(gè)亞型所占比例見圖1。

2.2 MFCM檢測 44例AML1/ETO陽性患者中多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)診斷AML1/ETO陽性患者36例，未能診斷的患者8例,流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析44例患者均表達(dá)CD117、CD34、CD33以及 HLADR，43例表達(dá) CD13 （陽性率為 97.73%），42例（95.45%）患者表達(dá)CD19，且CD117和CD34為強(qiáng)表達(dá)，CD19 為部分表達(dá)。 CD117、CD34、HLA-DR以及CD19的共表達(dá)率高達(dá)95.45%。而在44例AML1/ETO陰性患者中，均無此表型特點(diǎn)。AML1/ETO陽性的AML患者免疫表型見表1。

圖1 AML1/ETO陽性患者FAB分型各亞型所占比列

表1 AML1/ETO陽性的AML患者免疫表型特點(diǎn)

2.3 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和MFCM兩種檢測方法診斷AML1/ETO陽性AML的真實(shí)性和可靠性評價(jià)

2.3.1 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué) 詳見表2。

表2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷AML1/ETO陽性的AML的真實(shí)性和可靠性評價(jià)

2.3.2 MFCM 詳見表3。

由此可見,多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)診斷的靈敏度（81.82%vs25.00%)，符合率（88.64%vs62.50%)以及陰性預(yù)測值（84.00%vs57.14%)明顯高于形態(tài)學(xué)，漏診率(18.18%vs75.00%)明顯低于形態(tài)學(xué)，特異度(95.50%vs100%)略低于形態(tài)學(xué)，綜合診斷效能明顯優(yōu)于形態(tài)學(xué)。

表3 MFCM診斷AML1/ETO陽性的AML的真實(shí)性和可靠性評價(jià)

3 討論

AML1/ETO 融合基因由染色體 t （8；21）（q22；q22）易位累及第21號染色體的急性粒細(xì)胞白血病基因1(AML1)和第8號染色體的ETO（Eight twe nty-one）基因[17]。本研究AML1/ETO陽性患者中,骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)FAB分型為AML-M5占39%,AM L-M2及AML-M2a占34%，AML-M2b及提示AM L1/ETO陽性占25%,AML-M4占2%,與文獻(xiàn)報(bào)道[18]的其在 M2中高達(dá) 54.7%,余依次為M1 17.6%和M4 8.8%的結(jié)果略有不同,可能與樣本量或地域差異有關(guān)。

流式細(xì)胞術(shù)在急性白血病的診斷和分型中有重要價(jià)值[19,20],特異的免疫表型與疾病的預(yù)后以及細(xì)胞分子遺傳學(xué)異常相關(guān)[21-26]。國內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過AML1/ETO陽性的AML的免疫表型特點(diǎn)。如Paietta等[27]的研究結(jié)果顯示AML伴t(8;21)CD34表達(dá)的髓系原始細(xì)胞常常伴有CD19和CD56的表達(dá)，而CD33的表達(dá)減弱或缺失。國內(nèi)也有學(xué)者報(bào)道AML伴t(8;21)明顯高表達(dá)CD19和C D34,低表達(dá) CD 33[26,28]。這與本研究的結(jié)果基本一致。但從抗原表達(dá)的陽性率來看，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果差異較大。Felicetto等[29]應(yīng)用 CART和 Logistic回歸統(tǒng)計(jì)方法,將CD 19配合 CD 34預(yù)測t(8;21)的正確率達(dá)到98.9%，而增加任何指標(biāo)均不能提高診斷正確率,而最近又有文獻(xiàn)報(bào)道，CD34的表達(dá)陽性率僅為70.76%,CD19的陽性率為73.3 1%。其結(jié)合cCD79a和CD56建立積分診斷系統(tǒng)后進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積為0.952，診斷效能明顯提高[30]。其結(jié)果表明僅結(jié)合一種或兩種抗原的表達(dá)仍有局限,結(jié)合多種抗原的表達(dá)能提高診斷效能。本結(jié)果顯示44例AML1/ETO陽性的AML均表達(dá) CD117、CD34、CD33 以及 HLA-DR，43 例表達(dá) CD13（陽性率為 97.73%），42例（95.45%）患者表達(dá)CD19，且CD117和CD34為強(qiáng)表達(dá)，CD19為部分表達(dá)。CD19配合CD34預(yù)測AML1/ETO陽性的AML的陽性率為95.45%，這與Felicetto等的研究結(jié)果基本一致，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在44例AML1/ETO陰性患者中有1例患者存在CD19、CD34與CD117的表達(dá)，1例患者存在CD19、CD34與HLA-DR的表達(dá),故用CD19配合CD34再結(jié)合CD117、HLA-DR分析,結(jié)果顯示診斷陽性率不變?nèi)詾?5.45%,但在陰性患者中無1例存在CD117、CD34、HLA-DR以及CD19的共表達(dá)，提高了診斷的特異度和陽性預(yù)測值。

另外,骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和MFCM兩種檢測方法診斷AML1/ETO陽性的AML的真實(shí)性和可靠性評價(jià)的結(jié)果表明多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的綜合診斷效能高。分析原因可能是AML1/ETO陽性的AML細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性較大,在一定程度上限制了骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的診斷。而此類病人的免疫表型特點(diǎn)尤為獨(dú)特,不易造成漏診或誤診。在分析8例確認(rèn)AML 1/ETO融合基因陽性但流式細(xì)胞術(shù)沒有提示存在融合基因患者的免疫表型特點(diǎn),其中3例是由于編輯問題造成未能診斷，2例HLA-DR表達(dá)增強(qiáng)，2例無CD19表達(dá)，1例CD19表達(dá)增強(qiáng)造成未能診斷，見表1。

綜上所述,多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在AML1/ETO融合基因陽性AML的診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，CD117、CD34、HLA-DR 以及 CD19 的共表達(dá)是AML1/ETO融合基因陽性AML獨(dú)特的免疫表型，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)為此類病人早期診斷、分型和預(yù)后分層提供重要依據(jù)。