三陰性乳腺癌患者RGS20 mRNA表達(dá)水平及與臨床預(yù)后的關(guān)系分析

呂以東 ，李瑩 ，張彥武 ，牛耀東 ,嚴(yán)文君 ，王璐 ，馮愛強(qiáng)

（1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院乳腺科，河南 鄭州450052；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科分子遺傳實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052）

乳腺癌是女性中最為常見的惡性腫瘤,有極高的發(fā)病率，且其病死率僅次于肺癌[1]。三陰性乳腺癌是一種特殊亞型的乳腺癌,其癌組織免疫組化檢測雌激素受體、孕激素受體和原癌基因Her-2均為陰性，是一種侵襲性惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移幾率較其他類型乳腺癌高[2]。現(xiàn)代流行病學(xué)顯示三陰性乳腺癌預(yù)后較差，死亡風(fēng)險(xiǎn)很高，因此探索有效的分子靶基因?qū)θ幮匀橄侔┰缙谠\斷和治療有十分重大的意義[3]。G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子20（RGS20）是GTP酶激活因子，參與G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能活動(dòng)，但RGS20對(duì)三陰性乳腺癌預(yù)后的研究較少,本研究旨在通過分析RGS 20表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特征和生存情況的關(guān)系,擬尋求三陰性乳腺癌潛在的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年6月-2015年6月入院治療三陰性乳腺癌的患者82例臨床資料，年齡33~67 歲，平均（52.67±9.21）歲，均為女性，腫瘤>5cm 13例，≤5cm 69例,浸潤性導(dǎo)管癌37例、浸潤性小葉癌6例、其他浸潤性39例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例、無轉(zhuǎn)移49例，臨床分期Ⅰ-Ⅱ期58例、Ⅲ-Ⅳ期24例。采集患者乳腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織（癌距<3cm）,所有患者乳腺癌組織病理檢測確診為三陰性乳腺癌（ER陰性，PR陰性，HER-2陰性）[4]，排除其他惡性腫瘤，首次就診，術(shù)前均為接受其他放化療,無重要器官疾病，患者簽署知情同意書，本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 qRT-PCR檢測患者乳腺癌組織和癌旁正常組織中RGS20 mRNA的表達(dá) 取適量組織樣品于1mL Trizol裂解液中勻漿,充分裂解15min,于-80℃保存?zhèn)溆谩２捎寐确?異丙醇體系提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)率試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR PremixEX Taq試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,檢測樣品組織中GADPH、RGS20 mRNA的表達(dá),程序設(shè)置參數(shù)為：95℃ 5min，94℃10s，65℃ 50s，70℃ 2min，38 個(gè)循環(huán)。 以 GADPH mRNA的表達(dá)量為內(nèi)參,計(jì)算RGS20 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，獨(dú)立重復(fù)3次以上，引物序列[5]見表1。

1.3 免疫組化檢測三陰性乳腺癌患者乳腺癌組織中RGS20的表達(dá) 取出組織標(biāo)本烤蠟處理1h，二甲苯溶液脫蠟后酒精梯度水化，滴加3%過氧化氫溶液滅活，25℃孵育15min,置于枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，加熱狀態(tài)孵育10min，滴加RGS20一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，37℃孵育 30min，滴加DAB工作液避光孵育4min，蘇木素復(fù)染10s，酒精梯度脫水后滴加二甲苯至透明，封片；于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察。

RGS20陽性染色定位于胞漿,著色程度評(píng)分規(guī)則：棕褐色計(jì)3分，棕黃色計(jì)2分，淺黃色計(jì)1分，未著色計(jì)0分；著色細(xì)胞比例評(píng)分規(guī)則：大于75%計(jì) 4分，51%~74%計(jì)3分，26%~50%計(jì)2分，6%~25%計(jì)1分，小于5%計(jì)0分，最終得分為著色程度評(píng)分與著色細(xì)胞比例評(píng)分乘積，0~12分，其中0~4分評(píng)定為陰性表達(dá)，5~12分為陽性表達(dá)。以上評(píng)分過程由3位病理科高級(jí)醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行，最終以均值作為結(jié)果。

1.4 病例隨訪 隨訪截止至2018年6月30日，確保每位患者隨訪時(shí)間達(dá)到36個(gè)月,隨訪形式為：復(fù)診、上門、電話等。術(shù)后1年內(nèi),1次/月；術(shù)后第2年,1次/季；術(shù)后第3年，1次/半年。隨訪內(nèi)容為：了解患者無疾病生存期 (Disease Free Survival，DFS)、總生存期（Overall Survival，OS）和死亡原因。 DFS指患者首次治療到有疾病復(fù)發(fā)或疾病致死的時(shí)間間隔，OS指患者首次治療到任何原因致死的時(shí)間間隔,隨訪截止日期仍存活的患者以截止時(shí)間生存情況為準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間采用卡方（χ2）檢驗(yàn)；等級(jí)資料行秩和檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法分析生存率,生存期限比較采用Lo g-rank χ2法檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 基因GADPH和RGS20的引物序列

2 結(jié)果

2.1 患者組織中RGS20mRNA的表達(dá) 如圖1所示,三陰性乳腺癌患者癌組織中RGS20mRNA的表達(dá) 顯著高于癌旁組織（P<0.05）。

2.2 患者組織中RGS20的表達(dá) RGS20在三陰性乳腺癌細(xì)胞中定位于胞漿,顯微鏡下表現(xiàn)為胞漿呈黃棕色或黃褐色，如圖2。三陰性乳腺癌患者癌旁組織中RGS20的陽性表達(dá)率為15.85%（13/81）；而乳腺癌組織中為68.29%（56/81），顯著高于癌旁組織（P<0.05），見表 2。

圖1 患者組織中RGS20mRNA的表達(dá)

圖2 RGS20在三陰性乳腺癌細(xì)胞中陽性染色定位（免疫組化×400）

表2 患者組織中RGS20的表達(dá)

2.3 患者癌組織中RGS20表達(dá)與臨床特征的關(guān)系三陰性乳腺癌患者不同淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況、臨床分期及Ki67百分比等臨床病理特征中RGS20的表達(dá)表現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05），而不同年齡、腫瘤大小以及病理分類患者中RGS20的表達(dá)無明顯差異（P>0.05），見表 3。

表3 患者癌組織中RGS20表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.4 患者癌組織中RGS20表達(dá)與生存情況的關(guān)系如圖3，Kaplan-Meier曲線顯示陽性表達(dá)RGS20的三陰性乳腺癌患者3年DFS為42.86%，3年OS為55.36%；陰性表達(dá)RGS20患者3年DFS為65.39%，3年OS為80.77%。陽性表達(dá)pS6K1患者3年DFS和OS均顯著低于陰性表達(dá)患者 （Logrank χ2=3.904、4.957，P=0.048、0.026）。

圖3 患者癌組織中RGS20表達(dá)與生存情況的關(guān)系

3 討論

三陰性乳腺癌病情發(fā)展較快,腫瘤負(fù)荷大且復(fù)發(fā)早轉(zhuǎn)移高，嚴(yán)重威脅到女性生命健康[6]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確,研究表明三陰性乳腺癌多發(fā)于絕經(jīng)前年輕女性,目前并沒有針對(duì)三陰性乳腺癌的治療指南，主要以化療為主，化療治療三陰性乳腺癌有效率很高，但是化療藥物選擇性差，容易產(chǎn)生不良反應(yīng)，且預(yù)后差[7]。隨著對(duì)癌癥的深入研究，新型輔助化療藥物紫杉類、鉑類等對(duì)三陰性乳腺癌有一定的療效，但只有部分患者較敏感，能夠起到療效且有良好的預(yù)后[8,9]，故尋求出三陰性乳腺癌的腫瘤標(biāo)記物對(duì)于三陰性乳腺癌的診斷和治療有著極其重要的意義。G蛋白偶聯(lián)受體家族是一種細(xì)胞表面受體，參與細(xì)胞增殖、存活、運(yùn)動(dòng)等過程，并與腫瘤的生長、血管的生存和轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白是Gα亞基GTP酶活性增敏劑,可以放大GTP酶活性,是G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要因子[11]。G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有：⑴受體-G蛋白-Ac途徑,參與細(xì)胞分泌，肌細(xì)胞收縮,細(xì)胞通透性調(diào)節(jié)及胞內(nèi)各種酶促反應(yīng)；⑵受體-G蛋白-PLC途徑，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞一系列生物效應(yīng)[12,13]。G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白在多種癌細(xì)胞中有不同程度的表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，據(jù)報(bào)道RGS20基因低表達(dá)的Luminal型乳腺癌患者預(yù)后較好[14]，但RGS20的表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特征及生存時(shí)間的研究較少。

本研究通過qRT-PCR法和免疫組化法檢測到三陰性乳腺癌患者乳腺癌組織中RGS20的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,表明RGS20的表達(dá)能反映出腫瘤的進(jìn)展，可為腫瘤的早期治療提供指導(dǎo)。Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原,參與細(xì)胞有絲分裂過程,研究顯示浸潤型乳腺癌中Ki67與癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),常作為腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)記物[15,16]。通過分析三陰性乳腺癌患者臨床病理特征與RGS20表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有淋巴轉(zhuǎn)移、Ki67百分比＞14%及臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者RGS20陽性表達(dá)分別顯著高于無淋巴轉(zhuǎn)移、Ki67百分比≤14%及臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期的患者,揭示RGS 20高表達(dá)可能會(huì)提高癌細(xì)胞增殖能力和運(yùn)動(dòng)能力；而不同年齡、腫瘤大小和病理類型患者中RGS20陽性表達(dá)無顯著差異，揭示RGS20可能是一種新型的腫瘤靶點(diǎn)。隨訪36個(gè)月發(fā)現(xiàn)，陽性表達(dá)RGS20的三陰性乳腺癌患者3年DFS為42.86%，3年OS為55.36%；而陰性表達(dá)RGS20患者3年DFS為65.39%，3年OS為80.77%，表明RGS20陽性表達(dá)的三陰性乳腺癌患者生存時(shí)間更短，預(yù)后較差。

綜上所述，RGS20與三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),揭示RGS20可作為三陰性乳腺癌的潛在腫瘤標(biāo)記物,有助于三陰性乳腺癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估,為進(jìn)一步研究三陰性乳腺癌發(fā)病機(jī)制提供新的研究方向。后續(xù)還可繼續(xù)探討RGS20在其他類型乳腺癌中的表達(dá)情況及與臨床預(yù)后的關(guān)系。