江西省2013-2017年急性弛緩性麻痹病例相關腸道病毒感染監測分析

劉曉慶,李健雄，劉師文，肖芳，施勇，熊英

(江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029)

消滅脊髓灰質炎的最終目的是阻斷脊髓灰質炎野病毒的傳播,目前這一工作已取得了重大進展,并且Ⅱ型脊髓灰質炎病毒已從自然界消失[1]，事實上導致15歲以下的兒童出現麻痹的，除了脊髓灰質炎病毒外，還有許多非脊灰腸道病毒。近些年來，隨著脊灰病毒的消滅，由非脊灰腸道病毒引起的急性弛緩性麻痹越來越吸引人們的眼球。為了解NPEV的分布特征和流行病學規律,迫切需要對NPEV中的腸道病毒進行型別鑒定。近年來，國際上建立了應用分子生物學方法對腸道病毒進行分型鑒定的方法,為探索江西省急性弛緩性麻痹病例中的NPEV的感染情況,本研究對2013年-2017年從急性弛緩性麻痹(AFP)病例中分離到的NPEV進行分子定型，探討其型別分布情況以及流行病學規律。

1 材料

1.1 數據資料來源 AFP病例資料來源于AFP病例監測信息管理系統數據庫、江西省疾病預防控制中心脊灰實驗室監測數據。

1.2 糞便標本處理 來源于2013年-2017年江西省AFP病例監測系統報告的AFP病例(15歲以下兒童),絕大部分病例按照WHO的要求采集雙份糞便，所有糞便標本按照WHO《脊髓灰質炎病毒實驗室操作手冊》處理后接種于WHO推薦的RD和L20B細胞[2]，出現病變后，采用實時定量PCR（real-time PCR）方法進行脊灰病毒型別鑒定。本文對歷年來本實驗室保存的存的脊髓灰質炎病毒株進行病毒型別鑒定。

2 方法

2.1 病毒核酸的提取及引物設計 取病毒培養液200μl，按 QIAamp Viral RNA Mini kit（試劑生產批號：130188374）試劑5滴說明書操作。RT-PCR及測序引物參照文獻[3-5]按Oberste的方法選用不同的引物對（187/222，188/222，189/222）進行 VP1 區基因序列擴增，對用上述引物不能擴增的毒株，選用其他引物對擴增（187/011，040/011）擴增[6]，引物序列：

187：5′-ACIGCIGYIGARACIGGNNCA-3′；

188：5′-ACIGCIGTIGARACIGGNG-3′；

189：5′CARGCIGCIGARACIGGNGC-3′；

222：5′-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3′；

011：5′-GCICCIGAYTGITGICCRAA-3′

187：5′-ACIGCIGYIGARACIGGNCA-3′

040：5′-ATGTAYRTICCIMCIGGZGC-3′

2.2 RT-PCR與序列測定 RT-PCR反應條件參照文獻[3]，PCR產物經凝膠電泳（1.5%凝膠，0.5ug/ml溴化乙錠）檢測，陽性產物送上海生物工程有限公司測序。

2.3 結果分析 應用 Excel進行數據整理，應用SPSS 17.0統計學軟件分析。

3 結果

3.1 NPEV分離率 2013年-2017年江西省共報告AFP病例522例,分離獲得136株NPEV,AFP病例中NPEV的分離率各年有所不同,平均分離率為7.28%，詳見表 1、表 2。

3.2 時間分布 2013-2017年每個月均可分離到腸道病毒，NPEV有明顯的夏秋季高峰,分離率在5-8月均較高,5-8月份腸道病毒感染病例占49.81%，其中8月最高。見圖1。

表1 江西省2013年～2017年AFP及其接觸者NPEV分離情況

表2 不同年齡組AFP病例的非脊灰腸道病毒感染率

圖1

3.3 地區分布 腸道病毒感染AFP病例分布于11個市,吉安市AFP病例腸道病毒感染率最高，為12.42%，其次為萍鄉市 (12.24%)、新余市(11.39%)，景德鎮市未分離得到腸道病毒，九江市和南昌市較低，為1.3%和1.6%。

3.4 人群分布 腸道病毒感染病例年齡2月齡～13歲,主要為5歲以下兒童，占80.15%(109/136)。男性病例感染率為63.97% (87例),女性為36.03%(49 例),見表 2。

3.5 測序定型結果 PCR產物經凝膠電泳檢測，陽性產物送上海生物工程有限公司測序,陽性電泳圖譜見圖2。

對136株NPEV進行測序分型，132株有序列結果,分別屬于A組腸道病毒(HEV-A)，HEV-B和HEV-C，無HEV-D病毒株，HEV-A包括7個基因型49株(37.12%,49/132),HEV-B組毒株包括14個基因型82株(62.12%,82/132)，HEV-C組毒株包括1個基因型1株(0.76%,1/132)。 見表3、表4、表5。

圖2 部分非脊髓灰質炎腸道病毒PCR產物電泳圖譜

表3 2013-2015年江西省NPEV基因分型分組鑒定結果

表4 2013-2015年江西省基因分型鑒定基因A組結果

表5 2013-2015年江西省基因分型鑒定基因B組結果

4 討論

脊灰是嚴重危害兒童健康的急性傳染病，曾經是致殘的主要疾病之一[7]。消滅脊灰的工作目前已經取得重大進展，江西省2013年-2017年急性弛緩性麻痹病例中未監測到野病毒,證實江西已經消滅了脊灰野病毒，并實現了從1992年至今連續25年無脊灰野病毒病例發生的目標[8]。從而加強對AFP病例標本中非脊灰腸道病毒的監測,有助于進一步了解我省腸道病毒的循環特點。

本次監測結果顯示,江西省2013年-2014年AFP病例糞便標本中的非脊髓灰質炎腸道病毒的平均分離率為7.28%,其中最高為12.87%（2014年），最低為2.80%（2015年）；其感染有明顯的夏秋季節，與文獻報道的結果類似[9,10]。可能夏秋季溫暖濕潤的氣候有助于病毒的生存及繁殖；各地區的NPEV感染情況不同,其中景德鎮市未分離到非脊灰腸道病毒；各年齡組的感染率也不同，主要分布在5歲以下小年齡組兒童中,男性比例高于女性，與文獻[11]報道一致。

腸道病毒種類眾多，血清型可分為A、B、C和D共4個組。一種型別的腸道病毒往往可引起幾種疾病或病征,而一種疾病或病征也可因幾種型別引起。因此，對病原體進行分型鑒定，后續可以進一步了解病毒型別與臨床癥狀之間的關系，確定在一次疾病的暴發或流行中各病例間的流行病學關系,長期監測數據的積累可判斷腸道病毒血清型的流行趨勢。免疫接種過程中,部分小孩接種OPV后,會出現肢體麻痹等不良反應,其發生機制可能是由于疫苗株病毒的突變或返祖后對神經組織更具親嗜性,但從AFP病例中分離出的不同型別的非脊灰腸道病毒，是否是引起AFP病例麻痹的原因，其致病機制以及不同型別的非脊灰腸道病毒引起的臨床特征,將有待于進一步深化研究。基于全球消滅脊灰的進展，AFP病例的監測將重點關注NPEV的病原譜研究，病原譜的研究將為NPEV引起的疾病的診斷提供依據,為可能發生的暴發流行提供預測預警[12]。

近年來，隨著分子生物學技術的發展，國內外陸續建立了一些用于腸道病毒分型鑒定的方法，并使用此法鑒定了許多新型EV。這些方法基于RT-PCR，然后進行核苷酸序列分析或分子雜交。

本研究根據文獻報道設計了5對引物,對江西省省2013-2017年從急性弛緩性麻痹病例中分離到的136株非脊灰腸道病毒進行了VP1區基因擴增和序列分析。結果顯示，以A組和B組的為主，與云南省報道的結果一致[13]。其中A組的EV71型別所占比例最高，表明近幾年來江西省有EV71病毒的流行,但是否為江西省近5年非脊灰腸道病毒流行的優勢毒株,還需要結合這幾年的有關資料進一步分析判斷。

本次檢測中分離到的EV71型病毒,是能導致無菌性腦膜炎和手足口病的典型病毒,并可能引起暴發[14]。另外還分離到1株新型腸道病毒EV96，對新型腸道病毒詳細的臨床表現和流行病學特征有待進一步研究。江西省本次分離到的NPEV中，HEV-A和HEV-B和HEV-C組病毒都有，沒有發現D組病毒，并以HEV-B組最多,而A組的EV71是主要流行病毒。

通過對江西省2013-2017年AFP病例糞便中NPEV的研究,初步探討了AFP病例的NPEV病毒分布特點,也為今后江西省建立基于實驗室的病原學監測奠定基礎。