循環(huán)腫瘤細(xì)胞聯(lián)合血清CEA、CA199、CA125水平檢測(cè)對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌患者診斷效能的影響

林玉蘭，許立萍，孔祥臣

(1.焦作煤業(yè)(集團(tuán))有限責(zé)任公司中央醫(yī)院一分院內(nèi)二科；2.焦作煤業(yè)(集團(tuán))有限責(zé)任公司中央醫(yī)院呼吸二科，河南 焦作454000)

有數(shù)據(jù)顯示，肺癌5年生存率≤15%，且80%肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）,同時(shí)由于NSCLC早期癥狀不具有典型性，導(dǎo)致≥50%肺癌患者確診時(shí)已處于局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)期[1]。臨床早期篩查NSCLC的主要方式為電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）檢查及胸部，而CT檢查雖準(zhǔn)確度較高，但其費(fèi)用昂貴，輻射較強(qiáng)，患者難以接受；胸片檢查敏感性、準(zhǔn)確性較低，難以達(dá)到臨床預(yù)期效果。近年來(lái)由于影像學(xué)檢查敏感性較低，造成NSCLC病死率升高≥5%，因此提高晚期NSCLC診斷敏感性,有助于完全切除腫瘤病灶，改善患者5年生存率，挽救患者生命[2]。有學(xué)者指出,血清癌胚抗原（CEA）、糖類抗原199（CA 199）、糖類抗原 125（CA125）水平在早期及中晚期NSCLC診斷中雖具有一定診斷價(jià)值,但其漏診率仍高達(dá)29%[3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）與腫瘤血行轉(zhuǎn)移與腫瘤復(fù)發(fā)存在緊密聯(lián)系。本研究選取84例經(jīng)病理結(jié)果確診為晚期NSCLC患者,通過(guò)分析對(duì)比,觀察CTC聯(lián)合血清CE A、CA199、CA125水平檢測(cè)的臨床診斷效能。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年10月-2018年7月我院53例經(jīng)病理結(jié)果確診為晚期NSCLC患者為NSCLC組，31例肺部良性病變患者為肺部良性病變組,并選取56例同期健康體檢者為健康對(duì)照組。其中NSCLC組男32例，女21例，年齡45～75歲，平均年齡（60.15±7.04）歲，29 例腺癌，24 例鱗狀細(xì)胞癌，臨床分期：35例III B期，18例IV期；肺部良性病變組男19例，男12例，年齡46～76歲，平均年齡（59.98±6.92）歲，其中 4 例肺炎、8 例肺結(jié)核、10例支氣管擴(kuò)張、4例肺纖維化、5例結(jié)核性胸膜炎。健康對(duì)照組男30例，女26例，年齡44～77歲，平均年齡（60.07±6.98）歲。 3 組基本資料（年齡）均衡可比（P＞0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn) ⑴納入標(biāo)準(zhǔn)：患者及家屬知情并簽署同意書；NSCLC組均經(jīng)CT、磁共振成像（MRI）等檢查確診為NSCLC，均處于III B～I(xiàn)V期；⑵排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心肝腎等嚴(yán)重功能不全；伴有其他惡性腫瘤；伴有凝血功能異常；合并自身免疫系統(tǒng)疾病；嚴(yán)重精神疾病或認(rèn)知障礙。

1.3 方法

1.3.1 CTC檢測(cè)具體步驟如下 ⑴主要試劑：人淋巴細(xì)胞分離液(上海江林生物科技有限公司提供)、小鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體 （北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供）、4，6-二脒基-2苯基吲哚（購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司）、異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG（購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司）。⑵收集標(biāo)本：消毒后，以真空采血針取穿刺后肘正中7.5ml靜脈血,并加入肝素抗凝混勻，24h后富集腫瘤細(xì)胞。⑶富集腫瘤細(xì)胞（密度梯度離心法）：取抗凝全血（7.5ml）+磷酸鹽緩沖液（PBS，7.5ml）混勻，并以2：1比例加至細(xì)胞分離液層面上；在室溫條件下，2000r/min，離心時(shí)間持續(xù)20min，另外吸取環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層+PBS（5ml）洗滌，重復(fù) 2 次，2000r/min 離心 15min。 ⑷染色（免疫熒光法）：采用載玻片將單個(gè)核細(xì)胞懸液均勻涂抹，室溫下靜置30min后，采用多聚甲醛（4%）對(duì)抗原進(jìn)行固定,10min，PBS清洗,持續(xù)5min，重復(fù)3次，玻片干燥后統(tǒng)一置于-80℃冰箱進(jìn)行染色；室溫下采用Triton X-100（0.1%）通透包膜15min，PBS清洗5min，重復(fù)3次；將牛血清清蛋白（5%）封閉于37℃室溫下30 min,PBS清洗5min，重復(fù)3次；滴加1：100小鼠抗Pan-細(xì)胞角蛋白,并置于 4℃條件下12h，PBS清洗 5min，重復(fù)3次；滴加1：100 FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG，室溫條件下孵育2h，PBS清洗5min，重復(fù)3次；最后在細(xì)胞區(qū)添加DAPI染細(xì)胞核（7μl），對(duì)玻片加蓋封固，并利用免疫熒光顯微鏡對(duì)上述步驟進(jìn)行觀察與照相。

1.3.2 血清CEA、CA199、CA125水平檢測(cè) 采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 （產(chǎn)自北京西化儀科技有限公司）檢測(cè)血清CEA、CA199、CA125水平，嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書操作。

1.4 陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn) ⑴CTC：長(zhǎng)徑10μm；細(xì)胞形狀為橢圓形、圓形；經(jīng)光鏡可觀察細(xì)胞核及細(xì)胞形態(tài)完整；細(xì)胞質(zhì)經(jīng)Pan-細(xì)胞角蛋白染色被染成黑色或藍(lán)色。 ⑵CEA＞10U/ml,CA125＞35U/ml,CA199＞30.9U/ml。

1.5 觀察指標(biāo) ⑴比較兩組血清血清CEA、CA199、CA125 水平。 ⑵CTC、CEA、CA199、CA125及四者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果。⑶CTC、CEA、CA199、CA125及四者聯(lián)合準(zhǔn)確性（ACC）、靈敏性（SEN）、特異性（SPE）、陰性預(yù)測(cè)值及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用(x±s)表示，行 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用 n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清CEA、CA199、CA125水平 三組血清CEA、CA199、CA125水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；NSCLC 組血清 CEA、CA199、CA125 水平高于肺部良性病變組、健康對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清CEA、CA199、CA125水平(x±s)

表2 CTC、CEA、CA199、CA125及四者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

2.2 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果 CTC檢出真陽(yáng)性38例，真陰性29例，漏診15例,誤診2例；CEA檢出真陽(yáng)性32例,真陰性28例,漏診21例,誤診3例；CA199檢出真陽(yáng)性35例，真陰性26例，漏診18例，誤診5例；CA125檢出真陽(yáng)性30例，真陰性27例，漏診23例，誤診4例；四者聯(lián)合檢出真陽(yáng)性51例，真陰性25例，漏診2例，誤診6例，見表2。

2.3 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者聯(lián)合診斷價(jià)值 四者聯(lián)合ACC、SEN、陰性預(yù)測(cè)值高于CTC、CE A、CA199、CA125（P＜0.05）；四者聯(lián)合與 CTC、CEA、CA199、CA125陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、SPE無(wú)顯著差異（P＞0.05），見表 3。

表 3 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者聯(lián)合診斷價(jià)值 n（%）

3 討論

有數(shù)據(jù)顯示,每年肺癌死亡人數(shù)約占全國(guó)死亡人數(shù)的20%，對(duì)患者生命安全造成嚴(yán)重威脅[4]。目前臨床診斷晚期NSCLC的手段主要有影像學(xué)檢查、血清腫瘤標(biāo)志物、肺穿刺活檢等，其中血清腫瘤標(biāo)志物具有創(chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用便宜等顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)其SEN及ACC較高，可有效用于指導(dǎo)臨床晚期NSCLC診治。杜軍華等[5]研究發(fā)現(xiàn)，血清CEA、CA199、CA125水平升高與晚期NSCLC疾病進(jìn)展生存期有密切聯(lián)系,可有效指導(dǎo)臨床對(duì)晚期NSCLC療效及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估與判斷。

CEA是一種酸性糖蛋白,屬于腫瘤相關(guān)抗原（非器官特異性），多存在于胃腸道、泌尿道等空腔臟器，而糖蛋白主要成分為肽鏈、糖鏈，多位于組織細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、多核細(xì)胞及單核細(xì)胞）與末梢血中，是肺癌血清腫瘤標(biāo)志物之一[6]。趙松林等[7]研究發(fā)現(xiàn)血清CEA是評(píng)估晚期的重要敏感指標(biāo)之一，且其水平過(guò)度表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)有密切聯(lián)系。本結(jié)果顯示,觀察組血清CEA水平高于健康對(duì)照組（P＜0.05）,且其 SEN 為 60.38%，SPE 為 90.32%。提示血清CEA診斷晚期NSCLC SPE較高，在晚期NSCLC診斷價(jià)值較高。

CA125作為高分子糖蛋白,主要由體腔上皮細(xì)胞表達(dá)，健康者血清CA125水平較低，而組織發(fā)生惡變者血清CA125水平升高[8]。CA125最早主要應(yīng)用于診斷子宮癌與卵巢癌,而近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤（其他組織器官）中其水平也會(huì)提高，有數(shù)據(jù)顯示≥50%肺癌患者血清CA125水平存在升高現(xiàn)象[9]。王秋波等[10]研究發(fā)現(xiàn)，血清CA125半衰期較短，對(duì)晚期NSCLC治療效果具有監(jiān)測(cè)作用，可顯著反映肺癌近期變化。CA199是一種糖類抗原，屬于低聚糖類粘蛋白,多存在于惡性腫瘤細(xì)胞表面、胚胎胃腸粘膜上皮，是臨床診斷胰腺癌及直腸癌的血清腫瘤標(biāo)志物之一。近年來(lái)有學(xué)者指出，CA199具有廣譜性抗原，同時(shí)其水平在肺癌、卵巢癌等其他惡性腫瘤中也存在升高現(xiàn)象[11]。李嵐等[12]研究認(rèn)為，血清CA199在NSCLC化療效果評(píng)估中具有重要意義。本文結(jié)果顯示,觀察組血清CA1 25、CA199 水平高于健康對(duì)照組（P＜0.05）。 提示血清CA125、CA199對(duì)晚期NSCLC診斷具有指導(dǎo)意義。

NSCLC血行早期轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致異常增殖 （腫瘤細(xì)胞、相關(guān)腫瘤凋亡細(xì)胞）及單核細(xì)胞顯著增多，一般認(rèn)為晚期NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的必備條件是血清中相關(guān)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)表達(dá)異常[13]。范凡等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CTC與惡性腫瘤（乳腺癌等）的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可有效用于輔助盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。另外王漢萍等[15]研究還發(fā)現(xiàn)，CTC檢測(cè)可確定相關(guān)基因突變類型,為晚期NSCLC治療策略提供科學(xué)依據(jù)。此外費(fèi)小東[16]研究顯示CTC聯(lián)合多種腫瘤標(biāo)志物診斷晚期NSCLC,可有效提高晚期NSCLC診斷鑒別效果。本文結(jié)果顯示，四者聯(lián)合ACC、SEN、 陰性預(yù)測(cè)值高于 CTC、CEA、CA199、CA125（P＜0.05），且陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、SPE 無(wú)顯著差異（P＞0.05）。提示四者聯(lián)合診斷晚期NSCLC，可有效提高ACC及SEN，優(yōu)化診斷效果。

綜上所述，CTC聯(lián)合血清CEA、CA199、CA125水平檢測(cè)晚期NSCLC ACC及SEN較高，可為臨床選擇治療方案與判斷預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。