hsa-miR-144在結核性胸膜肥厚患者外周血中的表達及其與炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6的關系

焦淑靜，王紅坡

（1.商丘市第三人民醫院檢驗科，河南 商丘476000；2.新鄉醫學院第一附屬醫院磁共振科，河南 衛輝 453100）

結核性胸膜炎屬于結核分枝桿菌感染累及胸膜的一種炎癥疾病，發熱、胸痛、乏力、呼吸困難等是此病的常見臨床癥狀[1]。結核性胸腔積液中的纖維蛋白容易沉著在人體胸膜表面,產生積液包裹以及形成胸膜肥厚,進而發生限制性通氣障礙[2]。為此,在治療結核性胸膜炎疾病過程中應注重胸膜炎性反應的抑制、抑制胸膜增厚。miRNAs屬于近年來新發現的內源性非編碼小RNA,研究證實[3,4]其表達失調與腫瘤疾病、炎癥疾病的發生發展相關。目前,有關hsa-miR-144在結核性胸膜肥厚患者中的研究報道尚少。結核病和免疫緊密相關，研究證實[5]Thl細胞分泌出來的γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素 6(IL-6)等細胞因子參與了結核病患者的免疫病理過程。因此我們采用RT-PCR法檢測結核性胸膜肥厚患者外周血中hsa-miR-144的表達并分析其與血漿中炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6 的相關性,以進一步探討其在結核性胸膜肥厚發病中的作用,為臨床診治此病提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月-2018年3月河南省商丘市第三人民醫院80例臨床診斷結核性胸膜肥厚患者的外周血標本，其中男50例，女30例，年齡 21～65 歲，平均(41.3±2.4)歲；臨床表現：咳嗽、咳痰45例，胸疼25例，發熱伴胸疼10例；胸腔積液量 940～2830 ml，平均(2316.7±54.8)ml；發病至入院就診時間 1～10 d，平均(5.1±1.6)d；單純性結核性胸膜炎60例，肺結核合并結核性胸膜炎20例。入選標準：均經胸膜活檢病理確診或痰涂片抗酸染色陽性者；經胸部螺旋CT檢查顯示胸膜肥厚者[6]。排除標準：存在活動性肺內病變者；心、肝、腎及肺功能異常者；有神經系統疾病及代謝性疾病者；存在免疫缺陷病者;孕婦或哺乳期婦女；藥物過敏者;對胸腔穿刺引流術不可耐受者。另收集80例健康對照者的外周血標本，其中男48例，女32例；年齡 22～64 歲，平均(40.8±2.1)歲。

1.2 儀器和試劑 Ficoll淋巴細胞分離液購自北京中西遠大科技有限公司；Trizol試劑購自上海生工生物工程技術服務公司；Taqman miRNAs反轉錄試劑盒、Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser均購自上海捷瑞生物工程有限公司；SYBRRPremix Ex TaqTM購自北京寶日醫生物技術有限公司。 IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA 試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司。實時熒光定量PCR儀購自上海宏石醫療科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標本收集及處理 空腹采集研究對象的靜脈血5ml于肝素鈉抗凝管中，混勻備用。運用常規方法使用Ficoll淋巴細胞分離液提取PBMC。

1.3.2 hsa-miR-144的檢測 依據Trizol試劑說明書提取研究對象的PBMC總RNA，測定總RNA濃度及質量。運用SYBR法實施RT-PCR檢測，引物由北京密碼子生物科技有限公司設計及合成。采用Taqman miRNAs反轉錄試劑盒和miRNAs特異性莖環結構（stem-loop）反轉錄引物進行反轉錄反應。反轉錄條件：16℃孵育 2 min，42℃反應 1 min，50℃反應 1 s，40個循環，再 85℃孵育 5 min，4℃終止反應。預擴增反應條件：95℃ 10 min，55℃、72℃分別反應 2 min，95℃ 15 s，60 ℃40 min，12個循環，99.9℃孵育10 min。漩渦混勻TaqMan?通用PCR預混PCR反應液。hsa-miR-144熒光定量PCR引物。PCR反應條件：94.5℃反應 10 min，97 ℃ 30 s，59.7 ℃ 1 min，40 個循環反應。內參U6引物序列 ：上游引物5'-GCGCGTCG TGAAGCGTTC-3'，下游引物 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。hsa-miR-144引物序列：上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTCCCAGGA-3',下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TCAGTTGAGAGGGATTC-3'。以2-△△Ct表示結核性胸膜肥厚患者PBMC中目的基因的表達相對和健康對照者的變化倍數。

1.3.3 血漿炎性因子的檢測 應用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測定研究對象血漿炎性因子γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素 6(IL-6)表達水平。具體步驟依據IFN-γ、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒的說明書操作。正常值范圍：IFN-γ 為 0～20 ng/L,TNF-α 為 0～60 ng/L，IL-6 為0～40ng/L。

1.4 統計學處理 實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。符合正態分布定量資料的統計描述,采用均數±標準差(x±s)表示，兩樣本均數比較用t檢驗，hsa-miR-144與血漿炎性因子的相互關系采用spearman檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結核性胸膜肥厚患者與健康對照者PBMC中hsa-miR-144表達水平比較 通過RT-PCR法測定80例結核性胸膜肥厚患者與80例健康對照者PBMC中hsa-miR-144的表達差異。結核性胸膜肥厚組PBMC中的hsa-miR-14 4水平明顯高于健康對照組（P＜0.01），見圖 1。

2.2 結核性胸膜肥厚患者與健康對照者血漿炎性因子水平比較 ELISA法檢測結果顯示，結核性胸膜肥厚組血漿炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6分別為（47.16±4.08）ng/L、（72.83±3.22）ng/L、（61.97±5.1 1）ng/L，均明顯高于健康對照組（P＜0.05），見表 1。

圖1 RT-PCR法檢測PBMC中hsa-miR-144的相對表達量

表1 ELISA法檢測血漿炎性因子水平比較

2.3 相關性分析 spearman相關性分析顯示，結核性胸膜肥厚患者外周血PBMC中hsa-miR-144與血漿炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6水平存在相關性 （r=0.384，P＜0.05；r=0.396，P＜0.05；r=0.361，P＜0.05），見表 2。

表2 hsa-miR-144與血漿炎性因子相關分析（n=80）

3 討論

結核性胸膜肥厚屬于臨床常見的呼吸內科疾病，其發病機制尚不清楚[7,8]。相關資料顯示[9]，miR NA廣泛參與細胞侵襲、細胞凋亡等多種過程，也參與免疫性疾病等多種疾病的發生發展。近年，hsa-miR-144在結核病發生發展過程中的調控作用逐漸受到人們的關注及重視。如譚燕[10]采用實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測顯示，hsa-miR-144在肺結核病人血液中的表達明顯高于健康人員，且患者經治療后hsa-miR-144表達水平顯著下降。本文結果顯示，結核性胸膜肥厚組PBMC中的hsa-miR-144水平明顯高于健康對照組（P＜0.01）。提示hsa-miR-144與結核性胸膜肥厚發生發展相關，通過檢測外周血hsa-miR-144表達水平可用于結核性胸膜肥厚臨床診斷與療效評價。

作為一個重要的免疫調節因子，IFN-γ在結核感染中一方面可以促進Th1與巨噬細胞的炎癥反應，另一方面可以抑制Th2與嗜酸粒細胞的炎癥反應進而強化細胞的免疫應答作用[11]。TNF-α可以參與抗感染、發熱等多種病理生理過程，在結核感染中可以激發局部免疫細胞釋放許多趨化因子，誘導外周血單核細胞不斷遷移到病變部位以誘發遲發型的變態反應[12,13]。有研究顯示[14-16],IL-6與肺結核病變活動關系相關。本文結果顯示，結核性胸膜肥厚組血漿炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6均明顯高于健康對照組（P＜0.05）。提示結核性胸膜肥厚患者血漿中炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-6存在異常表達。并發現hsa-miR-144的表達與IFN-γ、TNF-α、IL-6呈明顯正相關,提示hsa-miR-144可能是通過促進致炎因子的表達，促進結核性胸膜肥厚的發生發展。

綜上所述，檢測體內hsa-miR-144及IFN-γ、TNF-α、IL-6細胞因子水平可以深入了解結核性胸膜肥厚的發病機制，有助于判斷疾病進程，評價患者的預后。此外，通過分析hsa-miR-144及IFN-γ、TNF-α、IL-6在外周血中分泌水平差別，有可能成為結核性胸膜肥厚臨床診斷的依據。