熱應激對體外小鼠早期囊胚發育至擴張囊胚期能力的影響

屈平平

（山東畜牧獸醫職業學院山東濰坊 261061）

夏季高溫是導致奶牛等哺乳動物不孕和妊娠失敗的主要原因，母牛在妊娠早期遭受熱應激后，胚胎的死亡率和畸形率也明顯增加[1-3]。驢為季節多次發情動物，7～9月份是德州母驢發情旺季，此時正值夏季高溫，不利于胚胎的著床和發育，易導致妊娠失敗；每年8～9月份，西藏野驢也進入繁殖交配期，如果西藏野驢引種至中原，也將面臨熱應激對其繁殖力的影響。本項目以小白鼠為動物模型，研究熱應激對哺乳動物胚胎發育的影響。試驗通過對小鼠早期囊胚進行不同程度的熱應激處理，觀察熱應激對小鼠早期囊胚的后續發育力的影響，為探索熱應激抑制奶牛等哺乳動物早期胚胎發育的機理提供一定的依據。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

試驗動物為昆明種（KM）8～9周齡性成熟小白鼠，體重25±0.5g，購買于山東大學實驗動物中心。飼喂顆粒飼料，自由飲水，并進行光照控制（6:00-18:00光照，18:00-6:00黑暗）；溫度控制在18～25℃。適應飼養一周后，用于超數排卵。

1.2 試驗藥品

NaCl，KCl，NaHCO3，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，EDTA，HEPES，BSA，谷氨酰胺，乳酸鈉，丙酮酸鈉，青霉素，硫酸鏈霉素，瓊脂糖，地衣紅（均購自Sigma公司）；PMSG和HCG購自寧波三生藥業；檸檬酸鈉，甲醇，乙酸，0.01MPBS等。

1.3 試驗器材

體視顯微鏡（SZX-12，日本OLYMPUS公司），超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司），CO2培養箱（Galaxy B，德國MMM公司），CO2培養箱（Steri-Cycle，美國Forma公司），透明加熱板（p w-1，日本富士平公司），熒光顯微鏡（SZX-14，日本OLYMPUS公司）。

2 試驗方法

2.1 小鼠胚胎體外培養

2.1.1 小鼠超數排卵將性成熟、生長健康的雌性昆明小鼠于16：00腹腔內注射PMSG（10IU/只），48h后腹腔注射HCG（10IU/只），雌鼠注射HCG后立即與成熟雄鼠1∶1合籠。次日早晨檢查陰道栓，有陰栓者備用。

2.1.2 小鼠受精卵收集及體外培養在檢出陰道栓的當天19:00左右，用頸椎脫臼法處死雌鼠，取出輸卵管和部分子宮角，在體式顯微鏡下，將形態完好的受精卵在Hepes-CZB中沖洗5次后，轉移至50μL預平衡6～12h的CZB培養液微滴中，每個液滴放置30枚胚胎，置于37℃、5%CO2、100%RH的CO2培養箱中進行培養。當胚胎發育至4-細胞期時，將胚胎轉移至葡萄糖-CZB培養液中繼續培養，直至發育至早期囊胚（圖1），用于后續試驗。

2.2 熱應激處理

將早期囊胚分別在39℃，5.5%CO2條件下和41℃，6%CO2條件下熱應激處理2h。熱應激結束后，將胚胎在37℃，5%CO2條件下繼續培養。對照組胚胎在37℃，5%CO2條件下連續培養。

2.3 熱應激后小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚的比例

分別在熱應激結束后24h時，在體式鏡下觀察熱應激早期囊胚發育到擴張囊胚的比率（圖2）。試驗重復4次，每個重復的胚胎數為45～50枚。

圖1 發育至早期囊胚的小鼠胚胎

圖2 發育至擴張囊胚的小鼠胚胎

2.4 熱應激后小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚的平均總細胞數

分別將熱應激后24h收集的擴張囊胚，置于1%和0.5%低滲檸檬酸鈉溶液中處理30min和20min，再移到3∶1（V/V）的甲醇-冰醋酸固定液中處理30min。而后將胚胎移至APES（3-aminopropyl-triethoxy silane）硅化的載玻片上，干燥后，滴加0.5mL1%醋酸地衣紅染色液，室溫下染色15～20min；水洗后，稍干燥，封片，鏡檢。記錄每枚胚胎的總細胞數。試驗重復3次，每個重復30～40枚胚胎。

3 結果

3.1 熱應激對小鼠早期囊胚育到擴張囊胚比率的影響

正常培養組（37℃連續培養）、溫和熱應激組（39℃2h培養）、強烈熱應激組（41℃2h培養）早期囊胚發育到擴張囊胚率分別為81.7±6.5%，80.8±6.4%和63.3±3.6%；與正常培養組相比，溫和熱應激組早期囊胚發育到擴張囊胚的比率差異不顯著。但是，強烈熱應激后小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚的比率降低了22.5%，與正常培養組和溫和熱應激組差異顯著（P＜0.05）。以上結果表明強烈熱應激顯著降低體外小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚的能力。

表1 熱應激對小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚比率的影響

3.2 熱應激對小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚總細胞數的影響

正常培養組、溫和熱應激組和強烈熱應激組小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚的平均總細胞數分別為57.11±1.7、49.89±1.3和42.22±2.0。與正常培養組相比，溫和熱應激組和強烈熱應激組早期囊胚發育到擴張囊胚的平均總細胞數分別減少了8個和15個，與對照組均差異顯著（P＜0.05），以上結果表明熱應激能抑制小鼠早期囊胚的細胞分裂，這可能是熱應激造成部分胚胎死亡的原因之一。

表2 熱應激對小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚總細胞數的影響

4 討論

國內外研究發現在合子形成期間對母鼠進行35℃12h熱應激，受精卵發育到桑椹胚和囊胚的比率明顯降低；41℃1～2h熱應激就能降低體外2-細胞期胚胎的囊胚形成率。也有學者發現43℃2h強烈熱應激顯著降低了體外桑椹胚的存活率和囊胚形成率。本試驗也發現，39℃2h的溫和熱應激對小鼠早期囊胚發育到擴張囊胚的比率幾乎沒有影響，但是41℃2h的強烈熱應激能顯著降低早期囊胚發育到擴張囊胚比率，說明小鼠早期囊胚不能耐受短時間的強烈熱應激。