復合酶法提取小米多酚及其抗油脂氧化作用的研究

閆巧珍，李瑋鈺，李玥霞，王曉聞，朱俊玲

(山西農業大學 食品科學與工程學院，山西功能食品研究院，山西 太谷 030801)

小米又名粟，屬禾本科，是五谷之首。小米中含有豐富的營養物質如蛋白質、氨基酸、多酚活性物質及優質不飽和脂肪酸等，易被人體吸收利用[1]。小米中的多酚類物質含量較高，種類較多，包含黃酮類、單寧類、酚酸類、花色苷類等，尤其是黃酮類物質含量極為豐富，這些生理活性物質表現出抗氧化、抑菌、清除自由基、抗衰老等獨特的生理功能[2]。

目前常用的小米多酚提取方法有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等。這些方法存在著得率較低、溶劑浪費的缺點。酶法提取技術已經被廣泛應用，生物酶可通過水解植物細胞壁使細胞膜內物質溶出，在提取過程中適當地加入酶有利于多酚的浸出，且反應溫度較低，可有效提高小米多酚的得率[3]。

目前，在調味品等食品行業中，食品添加劑的應用十分廣泛，但是市售調味品中所使用的添加劑大多數為人工合成，存在著一定的危險性，如：抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ等。所以，天然提取物作為添加劑應用在調味品等食品行業成為近些年來研究的熱點。丁培峰等[4]將納他霉素和茶多酚添加到醬油中，其防腐、抗氧化效果十分明顯且安全性大大提高。刁文睿等[5]研究了山西老陳醋在浸漬花生的過程中，花生多酚提取物對DPPH、ABTS自由基的清除能力都有顯著增加，說明多酚能很好地應用到調味品行業，從而提高調味品的營養價值。楊瑞麗等[6]添加茶多酚量達到0.5%時，對花椒油有很好的抗氧化效果。小米多酚中黃酮類化合物極為豐富，研究表明黃酮類作為一種天然色素對油脂有一定抗氧化作用，因此進一步增強其抗氧化性，發揮小米多酚的抗氧化能力，將這一優勢運用到調味品等食品行業中，對提高其營養價值和保健功能具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米(東方亮1號)、大豆油。

纖維素酶(10萬U/g)、果膠酶(5萬U/g)：南寧龐博生物工程有限公司；沒食子酸：天津市致遠化學試劑有限公司；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；聚甘油酯：鄭州市鴻科化工產品有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)：英博生物科技有限公司；叔丁基對苯二酚(TBHQ)：山東優索化工科技有限公司；AB-8大孔樹脂：東鴻化工有限公司；所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1100 可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；SC-3610 低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；YHG-400-BS-Ⅱ遠紅外快速恒溫干燥箱 上海躍進醫療器械有限公司；ST3100 實驗室pH計 奧豪斯儀器(常州)有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；FA25 高速組織分散均質機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；BT-100B數顯恒流泵、DBS-100電腦全自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將小米粉碎，過80目篩，脫脂、干燥處理后的小米粉密封避光保存。

1.3.2 小米多酚物質的提取

精確稱取5 g小米粉，加酶，搖勻。按試驗設計的方案，調節溶液pH，在設定的溫度下水浴一定時間后，冷卻離心，取上清液，得到待測液Ⅰ。取濾渣，加入70%乙醇，40 ℃下水浴1 h，離心，取上清液，得到待測液Ⅱ，合并提取液Ⅰ和Ⅱ， 并通過旋轉蒸發濃縮至一定體積，測定小米多酚得率。

1.3.3 小米多酚物質的測定

1.3.3.1 沒食子酸標準曲線的繪制

配制濃度為 0.01 mg/mL 的標準溶液，分別取1，2，3，4，5 mL 配制成的沒食子酸溶液，通過福林酚比色法測定吸光度。參照王若蘭等[7]采用微波輔助乙醇提取小米多酚的研究，稍加修改。繪制沒食子酸標準曲線。

1.3.3.2 小米多酚含量的測定

取小米多酚提取液 1 mL，通過福林酚比色法測定并記錄吸光值，計算出小米多酚得率，計算公式如下：

式中：K為提取液的多酚得率(%)；C為與提取液吸光度對應的多酚質量濃度(mg/mL)；N為稀釋倍數；V為小米多酚提取液的體積(mL)；W為小米粉末質量(g)。

1.3.4 酶法提取小米多酚的單因素試驗

精確稱取5 g小米粉，分別加入纖維素酶、果膠酶以及一定比例的混合酶(纖維素酶∶果膠酶為1∶1；纖維素酶∶果膠酶為7∶3；纖維素酶∶果膠酶為3∶7)，其酶濃度分別設置為0、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，其中0為空白對照；酶解時間設置為30，60，90，120，150 min；酶解溫度設置為30，40，50，60，70 ℃；pH值設置為2.5，3，3.5，4，4.5，5。根據預試驗結果，采用控制單一變量的方法，探究酶種類和各單因素對得率的影響，確定各單因素最佳水平[8]。

1.3.5 響應面法優化試驗

以小米多酚得率為響應值，探究4個單因素之間的交互作用與響應值的關系，優化酶法提取小米多酚的工藝參數，從而得出最優工藝條件，并且在此條件下進行驗證試驗。

1.3.6 小米多酚提取物抗油脂氧化作用試驗

按上述方法提取小米多酚凍干成粉，參考王若蘭等[9]采用大孔樹脂分離純化小米多酚的方法和條件，將小米多酚進行分離純化，其純度由16.7%提高到了49.2%，提高了2.9倍。

參考國家標準GB/T 5009.37-2003[10]，采用Schaal烘箱法，將不同濃度梯度純化后的小米多酚提取物0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%與乳化劑(4%聚甘油酯)漩渦混合后，加入20 g大豆油進行均質化處理?；旌暇鶆蚝笾糜?50 mL廣口瓶中，密封放置于60 ℃電熱烘箱中氧化，放置8 d，每隔2 d(第0，2，4，6，8天)定時取樣測定其酸價(AV)和過氧化值(POV)。

通過POV和AV探究不同比例對小米多酚抗油脂氧化的影響，確定其最佳比例濃度。同時，在最佳比例濃度下分別與等濃度(不超過國家標準添加量0.02%)TBHQ、BHT、BHA的抗氧化性進行比較，探究小米多酚抗氧化性的強弱。

1.3.6.1 POV的測定

根據國家標準規定的滴定法測定[11]。

1.3.6.2 AV的測定

根據國家標準規定的滴定法測定[12]。

1.3.7 數據分析與處理

試驗數據采用Excel數據統計軟件錄入，作圖均采用Origin 9.1進行繪制，運用 Design-Expert 10.0.8 軟件進行響應面分析，所有試驗獨立重復3次。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

由圖1可知，回歸方程為 y=14.65x+0.0559，R2=0.9992。沒食子酸濃度與吸光值呈現出良好的線性關系。

2.2 復合酶提取小米多酚的單因素試驗

2.2.1 酶種類及濃度的選擇

按照試驗設計方案，不同酶比例及酶濃度對小米多酚得率影響結果見表1。

表1 不同酶在不同濃度下的多酚得率Table 1 Polyphenols yield of different enzymes at different concentration

由表1可知，當纖維素酶∶果膠酶的比例為7∶3時，多酚得率最大，說明復合酶較單一酶作用效果好，故選取復合酶(纖維素酶∶果膠酶為7∶3)用作后續試驗研究。其他條件不變時，通過無酶溶劑萃取得到的多酚得率僅為0.66%。隨著酶濃度的增加，多酚得率增加，酶濃度大于1.0%時，多酚得率沒有顯著增大，這可能是因為酶和底物接觸受到限制。隨著酶濃度的升高，反應過程中逐漸消耗底物，使過量的酶不能充分發揮作用。考慮到成本，確定最佳酶濃度為1.0%，此時小米多酚得率為1.35%。

2.2.2 酶解時間對小米多酚得率的影響

設定單一變量為酶解時間，按照試驗設計提取小米多酚，結果見圖2。

圖2 酶解時間對小米多酚得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of millet polyphenols

多酚得率隨著酶解時間的延長先升高后降低，當時間達到90 min時多酚得率最高。當酶解時間小于90 min 時，由于時間過短，使多酚無法充分溶出，導致得率偏低；當酶解時間大于90 min時，由于時間過長，酚酸類物質發生氧化分解，導致多酚得率偏低。因此，酶解時間選為90 min，此時小米得率為1.41%[13]。

2.2.3 酶解溫度對小米多酚得率的影響

設定單一變量為酶解溫度，按照試驗設計提取小米多酚，結果見圖3。

圖3 酶解溫度對小米多酚得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of millet polyphenols

由圖3可知，多酚得率隨著溫度的升高先升高后降低，當溫度為60 ℃時得率最高。當溫度高于60 ℃時，酶容易受熱變性使活性降低。此外，小米多酚得率明顯下降可能是提取溫度過高，多酚物質對熱極不穩定，使得多酚物質的結構受到破壞，直接影響了多酚的得率。因此，酶解溫度選為 60 ℃，此時小米多酚得率為1.15%。

2.2.4 pH對小米多酚得率的影響

設定 pH值為單一變量，按照試驗設計提取小米多酚，結果見圖 4。

圖4 pH值對小米多酚得率的影響Fig.4 Effect of pH values on the yield of millet polyphenols

由圖4可知，當 pH 值低于3時，隨著pH值增加，多酚得率顯著增加；當pH值為3時，得率達到最大；當pH值大于3時，多酚得率逐漸降低，表明酶活性受到pH影響，酶的構象和底物的解離狀態發生變化[14]。因此，確定最佳pH值為3，小米得率為1.11%。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計與試驗結果

試驗設計因素水平見表2，試驗設計與結果見表3。

表2 試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 響應面設計試驗結果Table 3 Response surface design test results

運用 Design-Expert 10.0.8軟件對 29個試驗點響應值進行回歸分析，擬合后各個單因素的回歸模型為：Y=+1.514+0.047A-0.022B-0.050C+2.500E-003D+0.015AB-5.000E-003AC+5.000E-003AD-0.035BC+0.040BD+0.053CD-0.065A2-0.0874B2-0.114C2-0.081D2,調整后得：Y=+1.514+0.047A-0.022B-0.050C-0.035BC+0.040BD+0.053CD-0.065A2-0.0874B2-0.114C2-0.081D2。

方差分析見表4，回歸模型極顯著(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.3678)，證明可用本模型進行試驗分析和預測， R2=95.18%，RAdj2=90.36%，說明回歸擬合度較好。各考察因素對小米多酚得率影響順序依次為：A>C>B>D，即：酶濃度>酶解溫度>酶解時間>pH值。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

注：“*”表示顯著(0.01

2.3.2 各因素相互作用對小米多酚得率的影響

該試驗建立的模型中C，D的交互項在0.01水平極顯著，B，C和B，D的交互項在0.05水平顯著。因此，各測試因子對響應值的影響不是簡單的線性關系，僅靠簡單的單因素試驗不足以確定最佳工藝參數。C與D、B與C、B與D的交互作用對響應值的影響見圖5～圖7。

圖5 酶解溫度和pH值對小米多酚得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature and pH value on the yield of millet polyphenols

圖6 酶解時間和酶解溫度對小米多酚得率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis temperature on the yield of millet polyphenols

圖7 酶解時間和pH值對小米多酚得率的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis time and pH value on the yield of millet polyphenols

由圖5～圖7可知，C與D、B與C、B與D兩兩之間存在著相互作用，尤其是C與D之間更為顯著。由響應面圖可知，C與D之間曲面陡峭，等高線圖呈現橢圓形，B與C、B與D之間曲面較為陡峭，等高線圖較為橢圓，這與方差分析的結果相符合[15]。

2.3.3 響應面試驗的驗證試驗

在-1～1水平內，各因素對響應值都有一個最優條件。根據分析得出最優值，即纖維素酶濃度為 1.072%，酶解時間為88.157 min，酶解溫度為57.704 ℃，pH值為2.969。此時，模型預測值為1.529%。考慮試驗的實際性和合理性，選擇酶濃度為1.1%，酶解時間為88 min，酶解溫度為58 ℃，pH值為3.0，進行3次重復試驗，測得小米多酚的得率為1.521%±0.004%，與預測值十分接近，表明通過響應面法試驗得到的結論是可靠的。

2.4 小米多酚抗油脂氧化試驗

2.4.1 小米多酚最佳混合比例的確定

通過對大豆油的AV和POV進行定時測定，分別得出0，2，4，6，8 d后各小米多酚濃度對大豆油酸敗抑制效果的影響，見圖8和圖9。

圖8 不同濃度小米多酚添加量對大豆油酸價的影響Fig.8 Effect of different concentration of millet polyphenols on the acid value of soybean oil

圖9 不同濃度小米多酚添加量對大豆油過氧化值的影響Fig.9 Effect of different concentration of millet polyphenols on the peroxide value of soybean oil

由圖8和圖9可知，大豆油的AV和POV隨加速氧化時間的延長均呈上升趨勢，對照組和各個試驗組均表現出一定的酸敗，高溫加快油脂的酸敗速度。各試驗組所測定的AV和POV均高于空白對照組，說明小米多酚對大豆油的氧化能夠起到一定的抑制作用。加速氧化到第8天時，對照組與各試驗組的AV和POV均出現較大的差距，酸敗程度不一。當小米多酚的濃度小于0.02%時，大豆油的AV與POV和小米多酚的添加濃度呈現出負相關，當小米多酚的添加量為0.02%時，AV和POV最低，分別為3.0 mg/g和0.54 g/100 g，僅為空白對照組的65.2%、64.96%。當多酚濃度大于0.02%時，AV和POV繼續升高，不再呈現負相關，抗氧化效果減弱。這可能是因為多酚被氧化后出現副反應產生自由基后引發了連鎖反應，故濃度較高的多酚對油脂抗氧化表現出較差的效果。

2.4.2 小米多酚與抗氧化劑抗氧化效果的比較

0.02%小米多酚濃度為抑制大豆油酸敗的最佳濃度，將此濃度下的小米多酚與人工合成的抗氧化劑(BHA、BHT、TBHQ)進行抗氧化效果的比較。根據國家標準規定BHA、BHT、TBHQ在基本不含水的脂肪和油中最大添加量為0.2 g/kg[16]，故可采用等濃度的抗氧化劑進行試驗。通過POV和AV的測定，得出小米多酚與其他抗氧化劑抗油脂氧化效果，見圖10和圖11。

圖10 小米多酚與BHA、BHT、TBHQ作用下大豆油AV的比較Fig.10 Comparison of soybean oil acid value under the action of millet polyphenols, BHA, BHT and TBHQ

圖11 小米多酚與BHA、BHT、TBHQ作用下大豆油POV的比較Fig.11 Comparison of peroxide value of soybean oil under the action of millet polyphenols, BHA, BHT and TBHQ

對照組和各試驗組的AV和POV均呈上升趨勢，且高溫加快了氧化速度，空白對照(CK)的POV與AV都明顯高于各試驗組，各種抗氧化劑都體現出了較強的抗氧化性能。第8天測定時，各試驗組的POV與AV分別為小米多酚：0.56 g/100 g，3.0 mg/g；BHA：0.6 g/100 g，3.4 mg/g；BHT：0.68 g/100 g，3.6 mg/g；TBHQ：0.48 g/100 g，2.6 mg/g，得出抗氧化效果由高到低依次為：TBHQ>小米多酚>BHA>BHT。

3 結論

本試驗采用酶法提取小米多酚，得出最佳工藝條件為：在纖維素酶和果膠酶的最佳比例為7∶3的條件下，選擇酶濃度為1.1%，酶解時間為88 min，酶解溫度為58 ℃，pH值為3，得出小米多酚得率為1.521%±0.004%。在小米多酚的抗油脂氧化試驗中，當小米多酚的添加量為0.02%時，抗氧化效果最佳，與同等濃度的人工合成抗氧化劑相比，其抗氧化性強于BHA和BHT，遜色于TBHQ，體現出良好的抗氧化性能。故將小米多酚提取物作為添加劑運用到芝麻油、蠔油、蝦油、橄欖油等調味中具有重大的現實意義，能夠在改善食品味道的同時提高其安全性和營養價值。