米根霉NCU1011發酵豆渣開發甜醬生產工藝研究

萬茵，王登驍，肖明，馮思麟，付仔龍，劉婷，潘菲，付桂明*

(1.南昌大學 食品學院 食品科學與技術國家重點實驗室，南昌 330047；2.江西憶童年食品有限公司，江西 高安 330807)

豆渣是生產腐竹、豆腐和豆漿等豆制品的副產品[1]，是提取蛋白質后的大豆殘渣，干物質質量約占全豆的15%～20%，但初始水分含量一般高達80%～90%，因此運輸困難，且不及時處理很容易腐敗變質。目前豆渣的主要用作飼料、肥料，或者廢棄，對環境造成很大的危害[2]。相關研究表明，豆渣中有豐富的膳食纖維、蛋白質、脂肪、微量元素與甾醇類化合物等營養成分[3]。豆渣干基含水分8.31%，脂質12.4%，蛋白質19.32%，尤其是總膳食纖維含量高達51.8%[4]。豆渣中豐富的膳食纖維對于便秘、預防腸道癌變、減肥有良好的功效[5，6]。

為改善豆渣口感差、難以吞咽的缺點，進一步提高其營養保健功效，自古以來我國就有利用發酵豆渣制作食品的傳統，主要是利用產纖維素酶、蛋白酶和糖化酶的霉菌，開發各種豆渣發酵產品。湖北居民發酵豆渣的傳統工藝是用稻草自然接種豆渣發酵成霉豆渣[7]。江西會昌居民把紅曲霉接種到豆渣中，制作紅色會昌豆渣菌[8]。發酵后的豆渣有抗氧化，降低糖尿病患者對胰島素的依賴，減少膽固醇在血液中的含量等多種功效[9-11]，深受廣大消費者的喜愛。此外，日本學者Matsuo分別用少孢米根霉和米曲霉發酵豆渣制作出產品soybean residue-koji和soybean residue-tempe[12,13]。印尼居民利用鏈孢霉Neurospora發酵豆渣而得傳統發酵食品soybean residue-ontjom，豆渣的營養價值均得到大大提高。

米根霉具有較強的產淀粉糖化酶、纖維素酶和蛋白酶能力并產生發酵風味物質，是發酵豆渣的優良菌種。本文對豆渣初始水分含量、接種量、發酵時間3個因素進行單因素試驗和正交試驗，研究對發酵產物中還原糖、氨基酸態氮含量以及感官品質等指標的影響，優化獲得米根霉生產豆渣發酵甜醬的最佳工藝參數。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

米根霉菌株：RhizopusoryzaeNCU1011，本實驗室保藏菌種；新鮮豆渣：由高安市憶童年食品有限公司提供。NaCl、Na2CO3、福林試劑、甲醛溶液、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、95%乙醇、NaOH、丙酮、MES-TRIS緩沖溶液、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠、三氯乙酸、硫酸、重鉻酸鉀、石油醚等：均為國產分析純。蛋白酶液(300～400 U/mL)、淀粉葡萄糖苷酶(2000～3300 U/mL)、熱穩定α-淀粉酶液(10000～11000 U/mL)等：均為國產生化試劑。

1.2 儀器

05-002LD05型超凈工作臺 廈門精藝興業科技有限公司；LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；HWS-250型電熱恒溫培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；HJ-4A型磁力攪拌器 國華器械廠；SP-756P型分光光度計 美國品譜集團；HH-8型電熱恒溫水浴鍋 金壇市城西曉陽電子儀器廠；SHZ-4(Ⅲ)型抽濾機 上海錦賦實驗儀器設備有限公司；PH50-3A43L-A型顯微鏡 江西鳳凰光學科技有限公司；PHS-3C型精密pH計 上海實驗儀器廠；JA5003型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；KSW40-U型馬弗爐 上海新苗醫療器械制造有限公司；K9840型凱式定氮儀、SH220N型消解儀 濟南海能儀器股份有限公司。

2 試驗方法

2.1 工藝流程

工藝流程見圖1。

圖1 豆渣發酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of soybean residue

2.2 操作要點

2.2.1 菌種的活化培養

以 PDA培養基進行米根霉菌株活化，培養溫度為28 ℃，相對濕度為85%，培養至長滿孢子，用滅菌的生理鹽水洗脫孢子，以麥麩豆皮培養基，于28 ℃、相對濕度為75%的條件下發酵3 d，獲得豆渣發酵菌種曲料。

2.2.2 豆渣發酵

接種一定量米根霉菌種至裝有不同初始水分含量的滅菌豆渣中，攪勻?？刂婆囵B溫度為28 ℃，相對濕度為75%，發酵培養一段時間，待整個發酵豆渣甜醬全部變為深褐色，測定還原糖、氨基酸態氮含量并進行感官品質測評。

2.3 工藝參數單因素優化試驗

通過單因素試驗研究接菌量、發酵時間、豆渣初始水分含量對豆渣甜醬中還原糖及氨基酸態氮含量的影響，結合產品的感官品質，確定米根霉發酵豆渣甜醬最佳工藝。

2.3.1 菌種接種量對發酵甜醬品質的影響

選擇接種量分別為0.5%、1.25%、2%、2.75%、3.5%為本試驗的5個水平，于28 ℃、相對濕度為75%的條件下培養28 h，發酵結束后于121 ℃滅菌20 min，檢測還原糖、氨基酸態氮含量，并進行感官品質測評。

定期觀察豆渣甜醬狀況，探究不同米根霉接種量對發酵豆渣甜醬生產的影響，得出最優發酵菌種接種量。

2.3.2 豆渣初始水分含量對發酵甜醬品質的影響

調節豆渣初始水分含量為60%、65%、70%、75%、80%。在接種量為1.25%、28 ℃、相對濕度為75%的條件下發酵28 h，發酵結束后于121 ℃滅菌20 min，測定豆渣甜醬中還原糖含量及氨基酸態氮含量，并對其進行感官品質測評。探究豆渣水分含量對米根霉發酵生產豆渣甜醬的影響，得出最優發酵初始水分含量。

2.3.3 發酵時間對發酵甜醬品質的影響

以接種量為1.25%(V/W)，接種至備有豆渣初始水分含量為70%的豆渣中，于28 ℃、相對濕度為75%的條件下分別發酵16，20，24，28，32 h，發酵結束后于121 ℃滅菌20 min，以還原糖、氨基酸態氮含量及感官品質作為測定指標。定期觀察豆渣甜醬表觀狀況，探究發酵時間對醬類產品生產的作用變化，得出最優發酵時間。

2.4 正交試驗

在單因素試驗的結果基礎上，對接種量、發酵時間、豆渣初始水分含量設計L9(33)正交試驗表(見表1)，根據產品中氨基酸態氮、還原糖含量及感官品質確定出最佳的生產工藝。

表1 L9(33)正交試驗因素水平表Table 1 The L9(33) orthogonal experimental factors and levels

2.5 理化指標分析方法

豆渣中水分、氨基酸態氮含量分別采用稱重法[14]；GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態氮的測定》進行測定[15]；還原糖含量采用DNS法測定[16]；可溶性膳食纖維含量采用酶-重量法測定[17]。

2.6 感官評價方法

針對其外觀、質地及風味口感這3個方面進行感官品質評定，評定標準見表2[18]。評定一個產品結束后，填好評分表，以清水漱口，開始評定下一個樣品，待全部樣品品評完畢，收集評定結果，根據各屬性權重計算得到每個樣品的分值。每個屬性的等級及對應的分數為：優10～7分，良好6～4分，一般3～0分。

表2 感官品質評分標準Table 2 The sensory quality scoring standard

3 結果與分析

3.1 豆渣發酵單因素優化試驗

3.1.1 接種量對發酵豆渣品質的影響

圖2 接種量對發酵豆渣品質的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the quality of fermented soybean residue

由圖2可知，接種量在0.5%～2%時，豆渣發酵后的還原糖含量、氨基酸態氮含量以及感官品質測評值隨接種量增大而逐漸提高。在此范圍內，隨著米根霉接種量增加，菌種生長的延遲期縮短，產生的淀粉糖化酶、蛋白酶的能力隨接種量增加而提升，因此還原糖、氨基酸態氮含量迅速增長，且發酵豆渣風味感官品質也得到較大提升。當接種量為2%時，氨基酸態氮與還原糖含量均達到最高值，豆渣內外都均勻布滿菌絲，風味、口感得到提高。但在接種量超過2%時，發酵豆渣的感官品質反而隨著接種量增加而減小，原因可能是接種量過高，米根霉繁殖過快，菌絲密布，內外氧氣交換量不足，豆渣中的還原糖消耗過快，不足以給米根霉良好生長繁殖條件。同時豆渣含水量不均勻，米根霉生長繁殖不平衡，降低了發酵豆渣的品質。而接種量過低，不僅發酵時間長，發酵效率和發酵效果差，容易導致雜菌生長繁殖，造成發酵風味劣化，發酵失敗。因此，接種量確定為2%。

3.1.2 豆渣初始水分含量對發酵豆渣品質的影響

圖3 豆渣初始水分含量對發酵豆渣品質的影響Fig.3 Effect of initial water content on the quality of fermented soybean residue

由圖3可知，豆渣初始水分含量在60%～70%之間時，發酵后豆渣的還原糖、氨基酸態氮含量和感官品質隨水分增加而增加；當初始水分達到70%時，豆渣中還原糖與氨基酸態氮含量均達到最高值。此時能夠提供充足的氧氣，米根霉生長旺盛，產淀粉糖化酶能力較高，分解粗糖產生還原糖用于自身生長繁殖，還原糖含量達到頂峰。發酵后的豆渣呈現棕黃色，米根霉均勻鋪散于豆渣，細長密集的菌絲布滿發酵豆渣正反兩面。與此同時，還原糖含量的增加為米根霉生長提供了充足的碳源。米根霉大量繁殖，進一步促進了其產生蛋白酶，分解蛋白質產生大量氨基酸態氮，其含量達到最高值。此時發酵豆渣甜醬富有彈性，口感細膩，香味濃郁。當豆渣初始水分含量超過70%，各項指標一直在下降，發酵后的豆渣凝聚為團狀，說明隨著豆渣初始水分含量的增加，易因積聚水團使豆渣中空氣含量降低，同時發酵產生的熱量難以釋放至外界，不利于米根霉的繁殖，使得豆渣中還原糖、氨基酸態氮含量和感官品質降低。

3.1.3 豆渣發酵時間對豆渣品質的影響

圖4 發酵時間對豆渣品質的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of soybean residue

由圖4可知，米根霉發酵豆渣過程中，還原糖含量、氨基酸態氮含量總體呈現先上升后下降的趨勢。在16～28 h這段時間中，豆渣發酵后的還原糖含量、氨基酸態氮含量以及感官品質測評值均不斷增長。米根霉發酵豆渣產生淀粉糖化酶，分解豆渣中的粗糖生成還原糖，提供給自身生長繁殖。同時產生蛋白酶分解蛋白質生成氨基酸，通過纖維素酶的作用把豆渣中的膳食纖維微?；糠植蝗苄陨攀忱w維降解為水溶性多糖，增加可食纖維量，消除豆渣的粗澀感以及豆腥味[19]，提高其感官品質，改善豆渣的食用口感。隨著發酵時間的延長，發酵后期，代謝產物積累過多，局部溫度上升太快，導致長出的菌絲體自溶[20]，豆渣表面塌陷，并有異味產生。在28～32 h這段時間內，還原糖含量、氨基酸態氮含量、感官品質則呈下降趨勢，說明隨著發酵時間的推移，豆渣中米根霉不斷生長，發酵環境變差，水分含量與溫度的不適降低了米根霉的產酶量，維持自身生命活動所消耗的還原糖、氨基酸的量遠遠大于其分解粗糖、蛋白質生成的還原糖、氨基酸的量，使得豆渣中還原糖、氨基酸態氮含量逐漸降低。同時隨著發酵時間延長，米根霉會產生大量孢子，其與培養基結合程度增加，上方形成致密的菌落，不利于通氣和散熱，下方則易積水而產生氨味，影響發酵豆渣的品質。在發酵時間為16 h時豆渣表面只有少量菌絲，口感比較粗糙，此時發酵豆渣沒有明顯的發酵香味。當發酵時間在24～28 h之間時，菌絲迅速生長繁殖，發酵香味在28 h時最為濃郁，口感最為細膩。當發酵32 h時，豆渣甜醬表面布滿菌絲，開始出現孢子，伴有異味產生，口感黏稠。因此，選擇豆渣甜醬的最優發酵時間為28 h。

3.2 豆渣發酵正交試驗

豆渣發酵的溫度為28 ℃，分別選擇接種量(A)、加水量(B)、發酵時間(C)為因素進行正交試驗，以還原糖、氨基酸態氮含量為指標，進行正交試驗，結果見表3和表4。

表3 還原糖含量正交表Table 3 Orthogonal experimental results of reducing sugar content

表4 氨基酸態氮含量正交表Table 4 Orthogonal experimental results of amino acid nitrogen content

續 表

通過極差分析，固態發酵豆渣制作調味甜醬過程中，各因素對還原糖與氨基酸態氮含量的影響順序均為：接種量>初始水分含量>發酵時間。接種量對還原糖和氨基酸態氮含量的影響最大，A因素取A3。初始水分含量對還原糖和氨基酸態氮含量影響程度較大，B因素取B2。發酵時間對還原糖和氨基酸態氮含量影響程度最小，為次要因素，但發酵時間過長，容易造成發酵風味劣化，綜合分析，C因素取C2。所以，最優組合為A3B2C2，即接種量為2.75%，豆渣初始水分含量為70%，發酵時間28 h。

3.3 驗證試驗

按照3.2所得最優條件進行3次驗證試驗，得到發酵豆渣甜醬的還原糖、氨基酸態氮的含量分別達到了50.5 mg/g與0.25%。此外，可溶性膳食纖維含量從發酵前的0.25%提高到發酵后的10.5%，產品風味良好。

圖5 米根霉發酵豆渣Fig.5 The soybean residue fermented by Rhizopus oryzae

注：A表示滅菌后，B表示滅菌前。

4 結論

本文以生產腐竹后的廢棄豆渣為原料，接種米根霉 NCU1011，采用醬類固態發酵法，開發出一種高可溶性膳食纖維的豆渣甜醬產品，確定最優的發酵條件為：接種量2.75%、豆渣初始水分含量70%、發酵時間28 h。在此最優條件下所得發酵豆渣甜醬中氨基酸態氮、還原糖和可溶性膳食纖維的含量提高到0.25%、5.05%、10.5%，且口感細膩爽滑，發酵風味濃郁，營養與食用品質均得到提升，是一種營養豐富、口感風味俱佳的新型調味品，大大提高了豆渣的附加值。