基于木脂素生物合成的內生菌發酵五味子研究

許哲祥，劉玉潔，劉松梅*，鄭春英*

(1.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學生命科學學院，黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)，又名 “山花椒”，是藥食同源功能性保健食品[1]，因其酸、苦、甘、辛、咸五味俱全，其加工產品能保持五味子紅色素的鮮亮[2]，無需添加任何色素成分，因此民間常采用五味子代替花椒作為調味品使用。現代研究表明：五味子具有降血糖、鎮靜、止咳、緩解疲勞等作用[3-5]，其主要活性成分是以五味子醇甲為代表的木脂素成分，該類成分具有抗腫瘤、保護中樞神經、抗氧化、抗菌等作用[6-9]，是綠色食品、藥品的生產原料及功能型調味品的重要生產原料[10]。

寒地黑土造就了北方道地藥材五味子的優良品質、生物活性及保健、調味功能，由于無節制的采集使用，五味子現為北方瀕危藥用植物[11]。本文基于內生菌參與宿主植物體內成分的生物轉化、誘導藥用植物次生代謝產物的產生的觀點[12]，采用五味子內生菌發酵五味子，定向高效生產五味子木脂素成分；同時采用柱色譜法同時分離發酵五味子中4種木脂素成分，以最大限度地使用五味子原料，并為功能性調味品的生產提供精制原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康野生五味子：采自黑龍江省尚志地區；五味子內生真菌WJ1、WT4、TP2與GP5：由黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業實驗室分離自健康五味子植株； PDA培養基的配制方法參閱文獻[13]。4種五味子對照品(供含量測定用)：中國藥品生物制品檢定院。

1.2 儀器與設備

FL2200型高效液相色譜儀 浙江溫嶺福立分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵菌株的篩選

發酵樣品的制備：取已活化的五味子內生真菌WJ1、TP2、WT4與GP5，參閱文獻[14]，制備1×107CFU/mL的菌懸液；精確稱取五味子粉9 g(過40目篩)，置于三角瓶中，加水(料液比1∶5)，密封，作為底物(121 ℃高壓滅菌30 min)；分別取上述4種菌懸液及無菌水各5 mL加入到底物中(平行樣品制備10份)，置于空氣浴搖床中，發酵培養(培養條件：28 ℃，140 r/min，培養15 d)，取出，凍干，作為發酵樣品，備用。

發酵前后五味子木脂素成分的動態變化：采用HPLC法，方法及條件參閱文獻[15]。

對照品溶液的制備：以甲醇為溶劑，分別制備1.0 mg/mL的五味子木脂素(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)對照品儲備液；吸取各對照品儲備液1 mL，制成0.25 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

供試品溶液的制備：分別精密稱取上述各發酵樣品及生藥五味子1.0 g，以10 mL甲醇超聲提取60 min，取出，放冷，以甲醇補足減失的溶劑，過濾(0.45 μm微孔濾膜)，即為供試品溶液。

HPLC測定：分別精密吸取上述對照品溶液及供試品溶液10 μL(n=3)，進樣，測定，計算含量的動態變化。

1.3.2 發酵五味子中木脂素成分的分離

根據“1.3.1”篩選結果，取發酵菌株，按“1.3.1”方法制備五味子發酵樣品，取五味子發酵樣品200 g，80%乙醇(料液比1∶8)，85 ℃回流提取2次(每次2 h)，合并提取液，減壓回收溶劑至100 mL時，用乙酸乙酯(100 mL)萃取3次，萃取液濃縮至清膏(相對密度約為1.10)，將其通過硅膠柱層析，依次采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，分離工藝流程見圖1。

圖1 發酵五味子中4種木脂素成分的分離流程Fig.1 The separation process of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis

1.3.3 發酵菌株的鑒定

參閱文獻[16]采用形態學觀察、18S rDNA序列擴增及序列分析法。通用引物NS1、NS6及PCR產物測序均委托生工生物工程(上海)股份有限公司。所得序列數據提交GenBank 數據庫，采用Blast分析與GenBank中核酸序列進行比較，通過MEGA 6.0軟件構建系統發育樹，進行親緣關系和系統進化分析。

2 結果與分析

2.1 發酵菌株篩選結果

采用HPLC法，分別采用“1.3.1”中的4株五味子內生真菌發酵五味子后，其所含4種木脂素成分(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)含量發生了動態變化(此4種木脂素HPLC色譜峰分別采用對照品加入法得到確認)，其中以五味子內生真菌WJ1發酵五味子后，4種五味子木脂素成分提高顯著，結果見圖2；五味子發酵后4種木脂素成分含量測定結果見表1和圖3。

圖2 內生真菌WJ1發酵五味子后的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Schisandra chinensis fermented by endophytic fungus WJ1

注：A為混合對照品；B為五味子生藥；C為WJ1發酵五味子樣品；1為五味子醇甲；2為五味子酯甲；3為五味子甲素；4為五味子乙素。

由圖2可知，與生藥五味子相比，五味子經內生真菌WJ1發酵后，其4種木脂素成分含量發生顯著增長，并以五味子指標成分五味子醇甲的增長最為顯著；同時，對比圖1不難發現，五味子在發酵過程中還有其他成分的產生，說明五味子在發酵過程中發生了活性成分的動態變化。

表1 五味子發酵樣品中4種木脂素含量測定結果Table 1 Determination results of the content of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis samples mg/g

注：同生藥對照組相比，“*”為P<0.05，“**”為P<0.01；同陰性對照組相比，“△”為P<0.05，“△△”為P<0.01。組別1：WJ1發酵樣品；組別2：TP2發酵樣品；組別3：GP5發酵樣品；組別4：WT4發酵樣品；組別5：五味子生藥；組別6：空白對照組。

圖3 五味子發酵樣品4種木脂素含量測定結果Fig.3 Determination results of the content of four lignan ingredients in fermented Schisandra chinensis samples

注：組別同表1。

由表1和圖3可知，4株五味子內生真菌(WJ1、TP2、WT4和GP5)均能在某種程度上使發酵五味子樣品中4種主要木脂素活性成分得以提高，并以內生真菌WJ1的作用效果最明顯，與生藥五味子相比，WJ1發酵五味子樣品中4種木脂素(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素及五味子乙素)含量都得到顯著增長，其增長率分別為：38.21%、27.24%、25.03%、39.70%，而且均高于其他3株內生菌發酵樣品中活性成分的漲幅(P<0.01)。因此，選取菌株WJ1作為目的菌株發酵五味子，以最大化提高五味子中4種木脂素成分含量。

2.2 發酵五味子中木脂素成分的分離結果

采用對照品跟蹤法對WJ1發酵五味子中4種木脂素成分進行分離，隨行薄層層析檢視，合并相同組分，所得4個部位，分別記作Fr1～Fr4，Fr1減壓濃縮，重結晶得到五味子乙素(613.4260 mg，純度96%)；Fr2減壓濃縮，重結晶得到五味子甲素(348.3487 mg，純度95%)；Fr3減壓濃縮，重結晶得到五味子酯甲(128.4508 mg，純度97%)；Fr4減壓濃縮，粗品以AB-8大孔樹脂柱(1.5 cm×12 cm)純化，以20%乙醇(V/V)洗脫，所得粗結晶以乙醚-乙酸乙酯(1∶1)重結晶后得到五味子醇甲(1614.3684 mg，純度98%)。

上述結果說明，采用一次柱色譜分離法可以同時分離發酵五味子中4種主要木脂素成分，該工藝適合木脂素原料的生產。柱色譜分離法為五味子中木脂素成分分離的經典方法，盡管眾多文獻報道了五味子中木脂素成分的分離鑒定[17]，但涉及到一次柱層析同時分離五味子中4種主要木脂素成分的方法卻鮮有報道，本文采用硅膠柱層析方法同時分離純化發酵五味子中4種主要木脂素成分，為制備4種主要木脂素成分奠定了基礎。

2.3 五味子內生真菌WJ1鑒定結果

對五味子內生真菌WJ1進行形態觀察，在PDA培養基上，菌株生長迅速，最初呈白色，隨后密生小顆粒狀黑褐色孢子逐漸增加，菌絲致密，出現頭球狀分生孢子，孢子呈球形；基內菌絲無色，無可溶性色素。參閱《真菌鑒定手冊》[18]，初步認定WJ1菌株為絲孢科曲霉屬菌，結果見圖4。

(a) (b)(10×40)

WJ1菌株PCR擴增獲得1條 1284 bp的特異性條帶，將所得測序結果在GenBank中進行Blast同源性比對，然后用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹(見圖5)，WJ1與菌株AspergillusnigerHM347449.1的18S rDNA序列的同源性最高，相似性為99%。綜合菌體形態學鑒定結果，初步認定WJ1為黑曲霉(Aspergillusniger)。關于黑曲霉在調味品中的應用已有報道[19,20]，上述研究結果為深入開發WJ1奠定了基礎。

圖5 WJ1菌株的系統發育樹Fig.5 The phylogenetic tree of strain WJ1

3 結論

本研究采用內生真菌發酵五味子，旨在高效利用有限五味子資源生產五味子中4種主要木脂素成分，同時采用柱色譜分離法對發酵五味子中4種木脂素成分進行了分離純化，并對發酵菌株進行了鑒定。結果表明，采用五味子內生真菌WJ1發酵五味子后，五味子中4種主要木脂素成分(五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)含量均較發酵前得到了顯著提高，尤以五味子指標成分五味子醇甲含量提高最為顯著，上述研究說明：內生菌發酵法可定向轉化五味子中木脂素成分；同時，采用柱色譜分離法分離發酵五味子中4種主要木脂素成分工藝適合木脂素原料的工業化生產。上述研究對于功能性調味品的生產，可減少配方中五味子原料的使用，起到精制作用；同時，對具有潛在應用價值的發酵菌株WJ1進行了菌株鑒定，后續可利用該菌株固體發酵五味子，以改善五味子調味品中揮發性風味物質的含量和種類，為研制新型功能性調味品奠定基礎。