基于高通量測序技術鑒定酸漿水中的微生物

張斌，王曉聞

(山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801)

以酸漿水為點漿水制作的酸漿豆腐，是山西大同最北部廣靈縣的特色。酸漿水為淡黃色液體，澄清透明，味道偏酸，是由當地沿用原有的發酵液，通過向其中不斷補充新鮮的水，并露天自然發酵而成。由此制作而成的豆腐，不僅有濃郁的豆香，而且有獨特的酵香，推測這可能與酸漿水中含有的微生物有關。關于酸漿水中微生物的組成情況，國內外報道較少，因此本文將通過高通量測序技術對酸漿水中的微生物組成情況進行分析，并運用傳統的分離純化方法和試劑盒鑒定酸漿水中的微生物。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 原料

取自山西省大同市廣靈縣某豆業有限公司的新鮮酸漿水，取澄清透明、無泡沫的酸漿水于無菌離心管中，低溫貯藏運送至實驗室。

1.1.2 培養基

細菌培養基：營養瓊脂、營養肉湯。

分離乳酸菌用培養基：MRS 瓊脂培養基、MRS肉湯培養基，購于索萊寶生物科技有限公司。

API 50CHL乳桿菌鑒定試劑盒[1]：購于法國生物梅里埃(中國)有限公司。

1.1.3 儀器與設備

SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；HPP-9272電熱恒溫培養箱 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；BS 224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；0.25 μm×25 mm針式過濾器及相應規格濾膜 頗爾(中國)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高通量測序技術對酸漿水中微生物分類組成的探究[2-5]

在超凈工作臺的無菌環境中，將酸漿水原液利用針式過濾器收集在濾膜上，共收集10片濾膜，密封于無菌塑封袋中，置于-80 ℃保存，之后低溫運送至美吉云生物公司進行檢測。

1.2.2 酸漿水原液中微生物的富集

取酸漿水于營養肉湯培養基中進行擴大培養，37 ℃恒溫培養48 h，使微生物富集。

1.2.3 細菌的篩選

取擴大培養后的原液轉入營養瓊脂培養基中，采用平板劃線法培養，37 ℃恒溫培養24 h。待菌落長出，挑取單菌落使用營養肉湯培養基進行擴大培養，37 ℃培養24 h。再轉為營養瓊脂培養基進行分離篩選[6]，直至長出單菌落。

1.2.4 乳酸菌的分離純化

取經細菌培養基分離篩選的細菌轉入MRS瓊脂培養基進行平板劃線培養。分成兩類培養，一類為好氧培養，另一類為厭氧培養。兩種培養均需在37 ℃恒溫培養24 h。待菌落長出，挑取單菌落用MRS肉湯培養基進行擴大培養，37 ℃恒溫培養24 h。再將其轉入MRS瓊脂培養基進行分離純化[7]，重復此操作3次。

1.2.5 菌落的培養特征觀察

取菌落分散性較好、單一菌落豐富的培養皿，對其進行菌落的培養特征觀察[8]。

1.2.6 菌種的生化鑒定

使用API CHL培養基和API 50 CH 試劑條對菌株進行49項生化試驗鑒定，置于37 ℃恒溫培養24，48 h。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果分析

通過對高通量測序技術數據進行處理與分析，得到酸漿水中微生物的分類組成情況。

2.1.1 OTU物種分類統計

通過聚類操作，對樣本所有序列進行OTU劃分，并對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析，可得到一個樣本測序結果中菌種和菌屬的數目情況。從科水平到種水平的OTU總數表見表1，共有10個科，13個屬，17個種，其中有7個屬沒有注釋到種水平。伯克氏菌科的OTU總數為28，醋酸桿菌科的OTU總數為544，乳桿菌科的OTU總數為43318，諾卡氏菌科為6，丙酸桿菌科為2，葡萄球菌科為19，纖細桿菌目為8，莫拉氏菌科為5，交替單胞菌科為5，色桿菌科為9。結果表明：從科水平、屬水平到種水平，乳酸桿菌的OTU總數都處于優勢地位。

表1 從科到種的OTU總數表Table 1 The total number of OTU from family to genus

續 表

2.1.2 群落組成及系統發育樹分析

基于OTU數據表，利用R語言工具作圖，在屬水平上統計樣本的物種組成以及各物種的相對豐度，可制得群落餅圖，見圖1。酸漿水中的微生物群落中，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的物種豐度為43318，占比98.58%；醋酸桿菌屬(Acetobacter)的物種豐度為544，占比1.24%；其他菌屬的物種豐度為82，占比0.18%。同樣地，基于OTU數據表，選擇屬水平上分類信息對應的序列，根據最大似然法ML(maximum likelihood)，可構建屬水平上的系統發育樹，見圖2。

圖1 屬水平上的物種豐度餅圖Fig.1 Pie chart of species abundance at genus level

圖2 屬水平上的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree at genus level

由圖2可知，酸漿水中的微生物群落從屬水平上可大致分為三類：一類是乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，一類是由同一結點進化分支，兩兩之間互有親緣關系的菌屬，包括醋酸桿菌屬(Acetobacter)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、福格斯氏菌屬(Vogesella)、球衣菌屬(Sphaerotilus)、纖毛菌屬(Leptothrix)、萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、Cutibacterium以及Norank_o_JGI_0000069-P22，一類是葡萄球菌屬(Staphylococcus)。在這4類中，由圖2右邊的柱形圖可知，乳酸桿菌屬的柱形圖長度最長，即占比最高。綜上所述，在酸漿水微生物的群落組成中，因乳酸桿菌屬的物種豐度占比極高，由此可得乳酸桿菌為優勢菌。

2.2 酸漿水中微生物的分離純化結果

將酸漿水樣品進行細菌增殖、反復分離純化后，得到66株乳酸菌。在好氧條件下培養得到36株菌。在厭氧條件下培養時，觀察發現培養基中的菌落生長分布出現分層現象，說明存在兼性厭氧性乳酸菌，最后分離得到30株厭氧或兼性厭氧乳酸菌。

2.3 菌落的培養特征觀察

通過觀察分離培養得到所有菌落的特征[9]，確定了3株菌，分別為乳酸菌L1、乳酸菌L2、乳酸菌L3，其特征見表2。

表2 菌落的培養特征Table 2 Culture characteristics of colonies

2.4 菌種的生化特征鑒定

根據API 50CHL乳桿菌鑒定試劑盒的原理(乳酸菌發酵碳水化合物產酸，會使pH下降，使指示劑變色)，將其在37 ℃恒溫培養24，48 h，通過對照比色卡判讀兩次培養的結果，得到構成菌種的生化圖譜；通過對照數據庫即可得到菌名和可靠的鑒定結果。生化特征鑒定結果見表3。

表3 API 50CHL生化鑒定結果Table 3 Biochemical identification results of API 50CHL

續 表

2.5 菌種的鑒定結果

通過對菌落的培養特征進行觀察，根據API 50CHL乳桿菌試劑盒的生化鑒定結果，并對照鑒定系統的生化圖譜，可以得出：乳酸菌L1為乳明串珠菌(Leuconostoclactis)，鑒定百分率為92%，T指數為0.56(鑒定百分數越接近100%，T指數越接近1，鑒定結果越好)，共有27株；乳酸菌L2為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)，鑒定百分率為77.8%，T指數為0.99，共有13株；乳酸菌L3則為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，鑒定百分率為82%，T指數為0.23，共有26株。3種乳酸菌均為乳桿菌屬，與高通量測序結果一致。

3 結論與討論

酸漿水點豆腐制成的豆制產品在廣靈縣一帶由來已久，但是由于酸漿水獨特的地域特性，以及當地的小作坊式生產經營模式，鮮少有人了解到酸漿水的獨特存在，同時對酸漿水的研究也少之又少。本文通過高通量測序技術與傳統的分離純化相結合的方法，以及API 50CHL乳桿菌鑒定試劑盒對酸漿水中的微生物群落組成進行分析，結果表明：酸漿水中的優勢菌群為乳酸桿菌；從酸漿水中分離出66株乳酸菌，其中好氧菌為36株，厭氧或兼性厭氧菌為30株；經試劑盒生化鑒定，得到3種乳酸桿菌L1、L2、L3，其中L1為乳明串珠菌(Leuconostoclactis)，有27株；L2為德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)，有13株；L3為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，有26株。

L2德氏乳桿菌是最具有經濟價值的發酵乳酸菌之一，它產酸能力強[10]，分解代謝時可以產生使食物具有特殊風味的酸類和醇類，同時還能改善腸道微生態平衡，抑制有害物質產生，提高機體免疫力。L3植物乳桿菌在繁殖過程中能產生特有的乳酸桿菌素[11]，這是一種生物型的防腐劑，可以減少化工降解素的用量，降低養殖成本。植物乳桿菌還具有保健作用，它可以維持腸道內菌群平衡，對致病菌也有抑制作用，甚至可以抑制腫瘤細胞的形成。通過初步鑒定得出的這些菌，或許可以為酸漿水以后的工業化生產及經營發展提供一種新的思路。