SF、25-OH Vit D及miR-122水平在NAFLD患者中表達及臨床意義

郭筆紅 吳丹丹 鄺燕玲

【摘要】 目的：探討鐵蛋白（SF）、25羥基維生素D（25-OH Vit D）及微小RNA-122（miR-122）水平在不同程度非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患者中表達及臨床意義，為NAFLD診斷及嚴重程度的判斷提供科學依據。方法：選擇2017年11月-2019年5月來醫院就診并確診為NAFLD患者270例為NAFLD組，同期健康人群120例為HC組，分別檢測血清中SF、25-OH Vit D及miR-122水平。結果：NAFLD組患者SF和miR-122水平明顯高于HC組，差異有統計學意義（P<0.05），而25-OH Vit D水平明顯低于HC組，差異有統計學意義（P<0.05）;NAFLD男性患者SF和25-OH Vit D水平明顯高于女性患者，差異有統計學意義（P<0.05），而miR-122水平差異無統計學意義（P>0.05）;NAFLD患者SF和miR-122水平隨著NAFLD患者病情的加重而呈上升趨勢，不同程度患者之間差異有統計學意義（P<0.05），而25-OH Vit D水平呈下降趨勢，不同程度患者之間差異有統計學意義（P<0.05）;NAFLD患者血清中SF和miR-122水平與NAFLD病情嚴重程度呈正相關（r=0.592、0.639，P<0.05），而25-OH Vit D水平與NAFLD病情嚴重程度呈負相關（r=-0.617，P<0.05）。結論：NAFLD患者SF和miR-122水平明顯升高，且與病情嚴重程度呈正相關，而25-OH Vit D水平明顯下降，與病情嚴重程度呈負相關。因此，SF、25-OH Vit D及miR-122水平檢測對NAFLD診斷及嚴重程度的鑒別診斷具有重要的意義，值得臨床推廣應用。

【關鍵詞】 非酒精性脂肪肝 鐵蛋白 25羥基維生素D 微小RNA-122 表達

[Abstract] Objective： To investigate the expression and clinical significance of ferritin （SF）， 25 hydroxyl vitamin D [25-OH Vit D] and miR-122 in patients with different degrees of nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）， so as to provide scientific basis for the diagnosis and severity of NAFLD. Method： From November 2017 to May 2019， 270 patients diagnosed with NAFLD were selected as NAFLD group and 120 healthy patients were selected as HC group. The serum levels of SF， 25-OH Vit D and miR-122 were detected respectively. Result： SF and miR-122 levels in NAFLD group were significantly higher than those in HC group， the difference was statistically significant （P<0.05）， while the level of 25-OH Vit D were significantly lower than those in HC group， the difference was statistically significant （P<0.05）. SF and 25-OH Vit D levels in male NAFLD patients were significantly higher than those in female NAFLD patients， the difference was statistically significant （P<0.05）， but there was no significant difference between two groups in the level of miR-122 （P>0.05）. The levels of SF and miR-122 in NAFLD patients increased with the aggravation of NAFLD patients condition， with statistically significant differences among patients of different degrees （P<0.05）， while the level of 25-OH Vit D decreased， with statistically significant differences among patients of different degrees （P<0.05）. The levels of SF and miR-122 in NAFLD patients were positively correlated with the severity of NAFLD （r=0.592， 0.639， P<0.05）， while the level of 25-OH Vit D were negatively correlated with the severity of NAFLD （r=-0.617， P<0.05）. Conclusion： The levels of SF and miR-122 in NAFLD patients are significantly increased and positively correlated with the severity of the disease， while the level of 25-OH Vit D is significantly decreased and negatively correlated with the severity of the disease. Therefore， the detection of SF， 25-OH Vit D and miR-122 levels are of great significance for the differential diagnosis of NAFLD diagnosis and severity， and worthy of clinical application.

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD）是一種非酒精因素引起的以肝細胞內脂肪過度沉積為典型特征的肝病，是我國最常見的一種慢性肝病，約1/3的NAFLD患者將演變為脂肪性肝炎、肝硬化、肝衰竭甚至肝癌，應引起社會高度重視[1-2]。NAFLD發病機制十分復雜，研究表明，NAFLD的發生和發展與遺傳、環境、代謝、胰島素抵抗及應激相關因素等諸多因素有關[3-4]。鐵是人體代謝必需的微量元素，但過多的鐵能通過調節自由基的釋放而對人體組織和器官造成損傷，繼而導致多種臟器病變，SF是人體內鐵的主要貯存形式，當鐵攝入增加時，SF亦增加，是反映體內鐵負荷過多的有效指標[3]。25-OH Vit D主要生物作用是調節人體鈣磷代謝，但近年來研究發現，維生素D還具有保護人體心血管、調節人體免疫能力及減輕胰島素抵抗等諸多作用[5-6]。miR-122是最早發現的具有組織特異性的一種miRNAs，在肝臟組織中呈高度表達，有研究表明，miR-122在肝臟的生理功能和疾病發生方面發揮著重要的作用[7-8]。為此，本研究對SF、25-OH Vit D及miR-122水平在不同程度NAFLD患者和健康人群中表達及臨床意義進行了調查分析，探討其在NAFLD發生和發展中變化情況及臨床意義，為NAFLD早診斷、早治療及早預防提供科學依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年11月-2019年5月來醫院就診并確診為NAFLD患者270例，其中男183例，女87例，年齡23～65歲，平均（37.52±11.47）歲。（1）納入標準：符合2010年中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學編著的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[9]。（2）NAFLD病情嚴重程度判斷標準：根據肝臟多普勒彩色超聲結果來判斷[2，6]：①肝區近場回聲彌漫性增強（強于腎臟與脾臟），遠場回聲逐漸衰減;②肝內管道結構顯示不清;③肝臟輕至中度腫大，邊緣角圓鈍;④肝內彩色血流信號減少或不易顯示，但肝內血管走向正常;⑤肝右葉包膜及橫幅回聲顯示不清或不完整。具備①項和②～④項中任何一項者為輕度脂肪肝，具備①項和②～④項中任何兩項者為中度脂肪肝，具備①項和②～④項中任何兩項及⑤項者為重度脂肪肝，其中輕度、中度和重度脂肪肝分別為125、96和49例。同時選擇同期健康人群120例為對照組，其中男82例，女38例，年齡22～68歲，平均（38.65±12.53）歲。（3）排除標準：高血壓、高血脂、糖尿病、自身免疫性肝病、病毒性肝炎、藥物性肝炎、肝硬化、腎功能不全、心腦血管疾病、肝功能異常及有飲酒嗜好，長期每日飲酒量折合乙醇量男性>80 g、女性>40 g者。兩組患者的一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經同醫院倫理委員會同意批準，并經同患者及家屬知情同意，簽訂知情同意書。

1.2 儀器與試劑

BS800全自動生化分析儀、試劑、校準品及質控物均由mindray公司提供;IS 1200全自動化學發光分析儀、試劑、校準品及質控物由四川邁克公司提供;ABI step one plus熒光PCR分析儀由美國ABI公司提供;miRNA提取、miRNA逆轉錄及實時熒光定量PCR試劑盒均由德國Qiagen公司提供。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 研究對象于清晨空腹采用一次性采血針采集靜脈血于2支無抗凝劑的干燥管內，每管4～5 ml，均于室溫靜置30 min后于離心機內離心，其中一管用作SF和25-OH Vit D檢測，另外一管取上清液移至Eppendorf管中，于-70 ℃冰箱內冷藏備用，用于miR-122檢測。

1.3.2 SF和25-OH Vit D檢測 SF檢測采用BS800全自動生化分析儀免疫比濁法，25-OH Vit D采用IS 1200全自動化學發光分析儀進行檢測，檢測前對相應分析儀進行保養、校準及室內質控檢測，待室內質控結果在控后再進行研究標本檢測，確保檢測結果的準確性。所有操作均嚴格按照儀器和試劑說明書及科室內SOP操作規程進行。

1.3.3 RNA提取 采用吸附柱法提取RNA，所有操作均嚴格按照miReasy Mini Kit的操作手冊進行。具體操作：取低溫冷藏的血清標本400 ?l，加入2 000 ?l的QIAzol試劑中，于冰上融化后充分混勻，置室溫5 min，然后于離心機內離心15 min（12 000 g），取上層水相300 ?l轉移至新的離心管中，取加入450 ?l的100%乙醇，充分混勻，最后取30 ?l的RNease-free water溶解RNA，置于-80 ℃低溫冰箱內保存。

1.3.4 miR-122檢測 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測血清中miR-122的表達，取RNA樣本15 μl，4 μl Buffer RT和1 μl Mix，使用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒于PCR儀上進行miRNA的逆轉錄cDNA。（1）反應體系為：RNA模板2 μl，特異引物2 μl，SYBR緩沖液10 μl及無RNA酶的滅菌水4 μl。（2）擴增條件：95 ℃預變性10 min，然后以95 ℃

10 s→60 ℃ 20 s→72 ℃ 15 s循環45～70次，最后進行熔解曲線分析，所有操作均嚴格按照miRNA qRT-PCR檢測系統進行。（3）miR-122相對水平計算：采用2-ΔΔCT法計算濃度相對水平（Re），計算公式為ΔCTc=CTc目-CTc內，ΔCTn=CTn目-CTn內（c為NAFLD組，n為HC組）。

1.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 5.0統計軟件對所測數據進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，多組間比較采用F檢驗，相關性采用Spearman分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組SF、25-OH Vit D及miR-122比較

NAFLD組患者SF和miR-122水平明顯高于HC組，差異有統計學意義（P<0.05），而25-OH Vit D水平明顯低于HC組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 不同性別NAFLD患者SF、25-OH Vit D及miR-122比較

NAFLD男性患者SF和25-OH Vit D水平明顯高于女性患者，差異有統計學意義（P<0.05），而miR-122水平之間差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 不同程度NAFLD患者SF、25-OH Vit D及miR-122比較

NAFLD患者SF和miR-122水平隨著NAFLD患者病情的加重而呈上升趨勢，不同程度患者之間差異有統計學意義（P<0.05），而25-OH Vit D水平呈下降趨勢，不同程度患者之間差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 相關性分析

經Spearman相關性分析，結果顯示NAFLD患者血清中SF和miR-122水平與NAFLD病情嚴重程度呈正相關（r=0.592、0.639，P<0.05），表明SF和miR-122水平隨著NAFLD病情的加重而逐漸升高，而25-OH Vit D水平隨著NAFLD病情的加重而呈逐漸下降，與NAFLD病情嚴重程度呈負相關（r=-0.617，P<0.05）。

3 討論

NAFLD是西方國家最常見的一種肝臟疾病，成人發病率高達30%左右，我國發病率較低，但最近幾年隨著人們生活水平不斷提高及飲食結構的改變，NAFLD發病率呈逐漸上升趨勢，其發病率已位于所有肝病的第2位，且發病年齡逐漸年青化。NAFLD是一種可逆性肝病，若不能及時診斷、治療及控制，可繼發脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌等一系列并發癥，嚴重影響患者的生活質量，增加患者家庭及社會負擔[10-11]。NAFLD發病病因十分復雜，發病機制目前尚未完全明確，且早期臨床癥狀不典型，易被患者忽視，錯過及早發現和及早預防的良機。臨床診斷金標準是肝穿刺活檢，但創傷性強，且不利于病情隨訪及療效的判斷。因此，尋找特異性生化指標，對NAFLD早期診斷、病情評估、療效判斷及干預性預防并給予規范治療，對改善患者肝功能、控制病情進一步發展具有重要意義。

SF是人體內鐵的主要貯存形式，其水平隨著人體鐵攝入量的增加而增加，是反映體內鐵負荷過多的有效指標。鐵是人體內代謝必需的一種微量元素，肝臟是人體內鐵代謝的主要器官，但過負荷的鐵會在肝臟內堆積，鐵作為氧化劑激活氧化應激反應，促進自由基生成，引起肝細胞器的損傷和肝細胞死亡，導致肝損傷[3-4]。有關研究發現，多種肝臟疾病都存在鐵代謝紊亂的現象，過多鐵的沉積會加重肝纖維化和肝硬化的進程。最近幾年有研究證實，大多數NAFLD患者的肝臟組織存在鐵過多，且鐵在肝臟的沉積與臨床癥狀惡化以及肝相關疾病病死率密切相關[3-4，12]。本研究結果顯示，NAFLD患者血清中SF水平明顯高于健康人群，差異有統計學意義（P<0.05），與馬會民等[12]報導的結論基本一致，且SF水平隨著NAFLD病情的加重而呈上升趨勢，與NAFLD病情嚴重程度呈正相關（r=0.592），表明了SF在NAFLD的發生和發展中發揮了重要作用。

NAFLD主要是三酰甘油在肝細胞內沉積而引起代謝紊亂綜合征和胰島素抗抵癥，有研究表明，其發病機制可能與胰島素抵抗和慢性輕度炎癥有關。維生素D進入人體經羥化后形成具有活性的1，25-（OH）2D3，與維生素D受體結合，然后與維甲酸受體結合為復合物，調節胰島素受體表達和胰島素對葡萄糖轉運敏感染性，減少胰島素抵抗。同時，維生素D可有效抑制輕度炎癥反應，減少炎癥反應因子的產生。有關文獻表明，25-OH Vit D低水平對存在嚴重的胰島素抵抗及輕度炎癥的患者極易導致NAFLD的發生[13-14]。本研究結果顯示，NAFLD患者血清中25-OH Vit D水平明顯低于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05），與有關文獻報導的結論基本一致[5，13-14]，且其水平隨著NAFLD病情的加重而呈逐步下降趨勢，與NAFLD病情嚴重程度呈負相關（r=-0.617），這可能與25-OH Vit D低水平導致其減少胰島素抵抗和炎癥反應因子產生的能力下降有關。

microRNAs（miRNAs）是最近新發現的一種轉錄后調控基因的內源性非編碼的小RNA分子，長約18～25個核苷酸。miRNAs通過轉錄后對基因水平的調控，參與機體的生理及病理過程，與多種疾病的發生和發展有關[15-16]。miR-122是miRNAs家族成員之一，是最早發現的一種miRNAs，具有組織特異性，在肝組織內呈高度表達，約占肝組織miRNAs的70%。有研究表明，miR-122是人體內在糖和脂質代謝過程中發揮重要作用的一種重要因子，具有促進膽固醇和脂肪酸合成，抑制膽汁酸和脂肪酸氧化等作用，在肝臟脂質代謝調控中發揮廣泛的作用。最近有研究發現，miR-122表達水平的改變參與了調控HCV、HBV感染、非酒精性脂肪性肝病及肝臟腫瘤的發生和發展[17-18]。本研究結果顯示，NAFLD患者血清中miR-122水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05），與Salvoza等[10]報導的和肖琳等[8]報導的一致，且miR-122水平隨著NAFLD患者病情的加重而呈逐步上升趨勢，與病情嚴重程度呈正相關（r=0.639），表明miR-122可能在NAFLD的發生和發展中發揮了重要的作用。

本研究結果顯示，男性NAFLD患者血清中SF和25-OH Vit D水平均高于女性患者，差異有統計學意義（P<0.05），這主要可能與男、女生理結構差異有關。女性血清中SF水平低于男性可能與女性周期性生理月經，慢性失血而影響體內鐵攝入量，甚至造成體內缺鐵有關，25-OH Vit D水平低于男性除了可能與女性懷孕期間所需攝入量增加而補充不足有關外，還可能與女性從事戶外活動少，陽光照射時間短有關[19-20]。而不同性別NAFLD患者血清中miR-122水平之間差異無統計學意義（P>0.05），這可能與miR-122主要存在肝臟組織中，而不同性別人群肝臟組織不存在差異性有關，具體原因有待進一步研究。

綜上所述，NAFLD患者血清中SF和miR-122水平明顯升高，且隨病情的加重而呈上升趨勢，與病情嚴重程度呈正相關，而25-OH Vit D水平明顯降低，且隨病情的加重而呈下降趨勢，與病情嚴重程度呈負相關。同時，男性NAFLD患者血清中SF和25-OH Vit D水平明顯高于女性，而不同性別之間miR-122水平無差異。因此，SF、miR-122及25-OH Vit D水平測定，對不同程度NAFLD患者的診斷及嚴重程度的鑒別診斷具有重要的意義，值得臨床推廣應用。

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（收稿日期：2019-11-04） （本文編輯：張亮亮）