構建酶敏感型嵌合肽用于腫瘤光動力學治療*

2020-04-28 10:03:30程崟家張愛清

功能材料 2020年4期

田翔，程崟家，張愛清

(中南民族大學化學與材料科學學院，武漢 4330074)

0 引言

癌癥是當今世界上大多數國家非常棘手的一大難題。目前傳統的癌癥治療方法有化療、放療、和手術切除法。但是以上方法各有利弊，例如：在傳統的化療過程中，由于抗癌藥物本身缺乏對癌細胞的治療特異性，因此在治療腫瘤細胞的同時會對正常細胞造成損傷；放療的治療設備昂貴，其中的射線對病人的身體往往會造成很大的傷害；手術切除法雖然能夠去掉比較大的腫瘤，但是對于頭部腫瘤和心臟腫瘤等，手術難度極大，風險太高。隨著科技的發展，出現許多新型的癌癥治療方式，如光動力治療(PDT)[1]、光熱治療、基因治療和免疫治療等。其中，PDT主要利用特定光誘導光敏劑產生活性氧簇(ROS)，通過ROS誘導細胞凋亡或壞死，這種新型癌癥治療手段相較于傳統的癌癥治療手段，具有一系列優勢，包括對表面皮膚腫瘤的高效性和無創性，利用光控制的對腫瘤區域和時間的可選擇性，以及可以重復治療的特性，因此在腫瘤高效治療方面獲得巨大優勢。據文獻報道[2-5]，單線態氧作為ROS家族中的成員，能夠破壞腫瘤血管，激活針對腫瘤的免疫反應，最終誘導腫瘤細胞凋亡。但是單線態氧的半衰期短(<40 ns)，作用范圍有限(<20 nm)[6-7]。此外，常用的光敏劑如原卟啉(PpIX)、二氫卟吩等，雖然在特定波長的光照下能夠產生大量的單線態氧(1O2)，從而發揮PDT效應，但是其在水中的溶解性較差，不能有效靶向到腫瘤區域，因此嚴重影響其在生物體內進一步發揮PDT治療的效果。針對以上問題，如何將光敏劑運輸到細胞及其亞細胞器內，進而有效提高PDT的治療效果的策略正在被廣泛研究[6,8-11]。

本文設計并合成了一種能夠靶向進入癌細胞線粒體的兩親性嵌合肽 PpIX-GGK(TPP)G-GFLG-R8GD(PTGR)，利用其在水溶液中能夠發生自組裝行為，從而得到以疏水性光敏劑為內核，親水性多肽為外殼的兩親性前藥膠束，實現對疏水性光敏劑PpIX的有效負載。該前藥膠束主要利用靶向肽RGD特異性識別整合素αvβ3受體過度表達的HeLa細胞，并在R8肽的協助下快速穿膜進入細胞。在癌細胞質內過度表達的組織蛋白酶B的作用下，GFLG肽能夠發生特異性酶解斷裂[12]，從而導致膠束結構遭到破壞。在特定光照下，修飾在多肽側鏈上的三苯基膦(TPP)能協助光敏劑PpIX有效富集在癌細胞線粒體周圍，并產生大量活性氧，從而破壞癌細胞線粒體，誘導癌細胞凋亡或壞死。本文設計的嵌合肽具有較好的生物相容性和生物降解性，能夠避免不良的免疫反應。此外，該兩親性嵌合肽可以提高將光敏劑靶向運輸到癌細胞及其亞細胞器的能力，進而有效提高腫瘤的PDT治療效果。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

二甲基亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、甲醇、哌啶、二異丙基乙胺(DIEA)、三異丙基硅烷(TIS)、乙醚、水合肼、三氟乙酸、氫氧化鈉、無水硫酸鎂，國藥基團化學試劑公司；Fmoc-Lys(Dde)-OH(K)、Fmoc-Gly-OH(G)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(R)、Fmoc-Leu-OH(L)、Fmoc-Phe-OH(F)、Fmoc-Lys(Dde)-OH(K)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH(D)、1-羥基苯并三氮唑(HOBt)、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、2-氯-三苯甲基氯樹脂(2-Chlorotrityl chloride resin)，上海吉爾生化公司；2，7-二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)，碧云天生物科技有限公司；DMEM培養基、青霉素-鏈霉素、胎牛血清(FBS)，Gibco公司；噻唑藍(MTT), Geneview公司；4-羧丁基三苯基溴化膦(TPP)、原卟啉(PpIX)，阿拉丁試劑有限公司。

熒光分光光度計(RF-5301 PC，日本島津公司)；紫外分光光度計(Lambda Bio 40，美國鉑金埃爾默公司)；超分辨顯微鏡(德國徠卡公司)；納米粒度電位儀(Nano ZS ZEN3600，英國馬爾文公司)；透射式電子顯微鏡(Tecnai G2 F20 S-TWIN，美國FEI公司)；基質輔助激光解析飛行時間質譜儀(MALDI-TOF，美國布魯克·道爾頓公司)。

1.2 合成與表征

1.2.1 PTGR的合成

PTGR的合成路線如圖1所示。取三苯甲基氯樹脂(0.8 g，0.97 mmol/g)于多肽固相合成柱中，加入適量DMF進行溶脹45 min，溶脹結束后進行抽濾。向多肽固相合成柱中加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3當量)和DIEA(6當量)的DMF混合液，反應2h。反應結束后抽出濾液，并用DMF洗滌4次。然后向多肽固相合成柱中加入含有30%哌啶的DMF溶液反應10 min，抽取濾液，脫除FMOC保護基團。隨后向多肽固相合成柱中加入Fmoc-Gly-OH(2當量)，HBTU(2.4當量)，HOBt(2.4當量)和DIEA(2 mL)的DMF混合液，反應2 h，進行抽濾，并用DMF洗滌數次。重復以上脫保護、洗滌和縮合步驟，至合成的嵌合肽序列為PpIX-GGK(Dde)G-GFLG-R8GD。接著向固相合成柱中加入含有20%水合肼的DMF溶液反應5 min，抽取濾液，重復反應8次，脫去Dde保護基團，用DMF洗滌數次至水合肼被完全洗掉。加入4-羧丁基三苯基溴化膦(4當量)，HBTU(4.8當量)，HOBt(4.8當量)和DIEA(2 mL)的DMF混合液，反應2 h后抽濾。然后用DMF、甲醇、二氯甲烷洗滌數次，真空干燥。干燥后，向反應器中加入切落劑(體積占比為95% TFA、2.5% H2O、2.5% TIS)反應100 min后，收集濾液，經過旋蒸濃縮后，用冷乙醚沉淀后離心，真空干燥24 h，得到嵌合肽分子。多肽酶解前后的分子量均通過MALDI-TOF測得。

圖1 PTGR的合成路線

1.2.2 PTGR電勢和粒徑的測定

配置100 μg/mL的PTGR水溶液，取1 mL PTGR溶液裝入測試池內，使用納米粒度電位儀檢測其電勢和粒徑。

1.2.3 PTGR形貌的觀測

配置150 μg/mL的PTGR水溶液，取10 μL的PTGR溶液滴到銅網上，靜置一段時間后，用新配好的3%的磷鎢酸水溶液進行負染，用TEM觀測其形貌。

1.2.4 PTGR臨界膠束溶度(CMC)的測定

兩親性嵌合肽膠束的CMC[13-14]是以芘為疏水性熒光探針，由熒光分光光度計測得。精確稱量9.7 mg芘，使其溶于10 mL丙酮，然后稀釋至4.6×10-6mol/L。向已配好的一系列濃度的3.6 mL PTGR溶液加入45 μL已配好的芘的丙酮溶液。將配置好的樣品放入搖床(150 r/min 37 ℃)震蕩24 h，讓丙酮完全揮發。利用熒光分光光度計測定溶液在360～400 nm范圍內的激發光譜，設定激發波長為342 nm，發射光和激發光的狹縫狹縫寬度均為5 nm。記錄一系列濃度的溶液在393 nm與374 nm處的熒光強度。以兩個位置的熒光強度比值作為縱坐標，以溶液濃度的對數為橫坐標作圖，找出兩條直線的交點對應的橫坐標值，從而計算得到該膠束的臨界膠束濃度(CMC)。

1.2.5 PpIX紫外標曲的測定

配置一系列不同濃度的PpIX的混合溶液(體積占比為1% DMSO、99% H2O)，以純水的紫外可見光吸收光譜為基線，利用紫外分光光度計檢測PpIX溶液在300～650 nm波長范圍內的吸收光譜。記錄一系列濃度梯度的溶液在400 nm處的吸光度，以吸光度的強度作為縱坐標，PpIX溶液的質量濃度作為橫坐標，從而得到PpIX的紫外標曲。

1.2.6 PTGR單線態氧產生性能表征

通過DCFH-DA檢測混合溶液在光照下525 nm處的熒光值的升高來表征單線態氧的產生，將DCFH-DA用0.01 mol/L NaOH處理0.5 h使其轉化成DCFH。配置兩組100 μg/mL的PTGR水溶液，隨后加入提前處理好的探針DCFH，使DCFH的最終溶度為20 μmol/L。將第一組材料溶液置于680 nm激光(30 mW/cm2)下照射,每隔一定時間用熒光分光光度計測定在488 nm激發波長下，PTGR溶液在525 nm處的熒光強度值。第二組材料在避光條件下重復上述熒光檢測的方法。

1.2.7 細胞實驗

(1)共聚焦觀測細胞對材料的內吞

將人宮頸癌細胞(HeLa)、非洲綠猴腎細胞(COS 7)分別接種到共聚焦培養皿中培養24 h，加入相當于5 μg/mL的PpIX的PTGR溶液。培養4 h后，向培養皿中加入Hoechst33324染色30 min，用PBS洗滌培養皿3次，并通過超分辨顯微鏡觀測(激發波長：488 nm，PpIX接收通道：(630±10)nm。

(2)共聚焦光測材料靶向細胞線粒體

將人宮頸癌細胞(HeLa)接種于共聚焦培養皿中培養24 h，加入相當于5 μg/mL的PpIX的PTGR 溶液。培養4 h后，向培養皿中加入線粒體染料Mito Tracker Green染色30 min，用PBS洗滌3次，并通過超分辨顯微鏡觀測(激發波長488 nm，PpIX接收通道(630±10)nm，Mito Tracker Green接收通道(540±10)nm)。

(3)共聚焦觀測細胞內的ROS生成

將HeLa細胞接種于共聚焦培養皿中培養24 h，加入含有5 μg/mL的PpIX的PTGR溶液。培養4 h后，加入DCFH，使DCFH在培養皿內的最終濃為20 μmol/L。繼續培養30 min后，在680 nm激光(30 mW/cm2)下照射1 min，用PBS洗滌三次培養皿，并立即通過超分辨顯微鏡觀測(激發波長488 nm，接收通道(525±10)nm)。

(4)共聚焦光測細胞線粒體損傷

將HeLa細胞接種于共聚焦培養皿中培養24 h，加入相當于5 μg/mL的PpIX的PTGR 溶液。培養4 h后，加入染料JC-1染色30min，在680 nm激光(30 mW/cm2)下照射1 min，用PBS洗滌3次，并通過超分辨顯微鏡觀測(激發波長488 nm，monomeric JC-1接收通道(520±10)nm，aggregated JC-1接收通道(580±10)nm)。

2 結果與討論

2.1 PTGR的結構與性質表征

如圖2(a)，利用MALDI-TOF對合成的PTGR進行了表征。PTGR的理論分子量是3081，MALDI-TOF結果顯示該材料的分子量為3081，此分子量和理論分子量一致，證明了PTGR的成功合成。如圖2(b)，利用MALDI-TOF對酶解24 h后的PTGR 進行表征，與酶解前的相比，新出現了分子量為500、1 284和1 498的3個峰與PTGR含有的多肽片段LGRR、R7GD和GR8GD分子量相吻合，表明了PTGR 能夠被組織蛋白酶B瓦解。利用TEM觀測PTGR在水溶液中的自組裝形貌，由圖3(a)所示，不難發現，PTGR通過自組裝形成了尺寸在60 nm左右的球形納米顆粒，分布比較均勻，表明鍵接上PpIX的多肽自組裝結構比較穩定，具有較好的分散性。此外，利用納米粒度電位儀分別檢測PTGR材料的電勢和粒徑。實驗結果(表1)進一步表明PTGR在水中能夠有效組裝成尺寸為140 nm左右的納米粒子，而且表面電勢為+21.1 mV，有助于PTGR快速穿過細胞膜進入癌細胞。其中，TEM觀測到的納米顆粒尺寸比納米粒度電位儀檢測出的粒徑小，是由于PTGR在TEM測的是其干態下的納米粒徑，而納米粒度電位儀表征的是其水合粒徑[15]。據報道[16]，具有兩親性結構的納米材料在一定濃度的條件下會自組裝形成膠束，同時將芘包埋在其疏水性內核中，從而引起芘的熒光發生變化。因此，用疏水性的芘做為熒光探針，對PTGR的CMC進行測定，如圖3(b)所示，PTGR的CMC值是1.5 μg/mL，表明PTGR在極低的濃度下能夠自組裝形成膠束，且納米膠束的結構緊湊。如圖3(c)所示，利用紫外分光光度計對PpIX的濃度進行標定，得到PpIX的紫外標準曲線，從而標定PTGR中的PpIX含量。

圖2 (a)PTGR及(b)PTGR酶解后的質譜

表1 PTGR的粒徑和電勢

圖3 PTGR的(a)透射式電子顯微鏡圖像，(b)臨界膠束濃度(CMC)和(c)PpIX 的紫外標準曲線

圖4 PTGR溶液分別在避光和680 nm激光(30 mW/cm2)誘導條件下，DCF在525 nm處的熒光強度隨光照時間的變化

最后對PTGR產生ROS的性能進行了探究，如圖4所示，通過熒光分光光度計檢測，發現在360 s內，在680 nm激光的誘導下，PTGR溶液在525 nm處的熒光強度比初始的熒光強度高了20倍，而避光條件下的PTGR溶液在525 nm處的熒光強度變化較小。表明PTGR在特定波長的激光誘導下，能夠在短時間內產生大量的ROS，從而具備殺死細胞的潛力。而在避光的情況下，產生的ROS較少，則對細胞的毒性較小。因而可以通過光照時間的長短和光照區域的不同，控制PTGR產生ROS的量和位置，從而發揮光動力治療。

2.2 細胞實驗

2.2.1 對癌細胞靶向能力的檢測

由圖5可知，HeLa細胞的細胞核周圍出現了大量的PpIX的紅色熒光，而COS 7細胞的細胞核周圍的紅色熒光較少。這是由于PTGR中含有靶向肽RGD，能夠識別HeLa細胞表面過度表達的整合素αvβ3，在穿膜肽R8的引導下，光敏劑PpIX能夠快速被運輸到HeLa細胞內。由于HeLa細胞內過度表達的組織蛋白酶B能有效切斷GFLG序列，最終導致PTGR膠束瓦解并釋放出PpIX。但是，正常細胞COS 7表面表達整合素αvβ3較少，導致出現在COS 7細胞內的PpIX較少。該實驗證明PTGR能夠有效的被癌細胞內吞并釋放出PpIX。

圖5 PTGR分別與HeLa細胞和COS 7細胞共同培養4 h的共聚焦顯微鏡圖像。比例尺：20 μm

2.2.2 對癌細胞線粒體靶向能力的檢測

如圖6所示，PpIX的紅色熒光與Mito track green的綠色熒光能夠很好的重合，這是由于PTGR材料經過HeLa細胞內吞后釋放PpIX，隨后在TPP的引導下，PpIX能有效到達HeLa細胞的線粒體周圍。這為PTGR在亞細胞器周圍發揮光動力治療提供了可能。

圖6 PTGR靶向線粒體的能力，綠色熒光為Mito Tracker Green，紅色熒光為PpIX。比例尺：20 μm

2.2.3 對PTGR在細胞內產生ROS性能的檢測

如圖7所示，實驗組的HeLa細胞內產生強烈的DCF的綠色熒光，這是由于PTGR在680 nm波長的激光光照下產生大量的ROS，將不發光的DCFH氧化為發綠色熒光的DCF。而空白組和對照組培養的HeLa細胞中幾乎沒有綠色熒光區域，表明避光條件下的PTGR在細胞內基本沒有產生ROS。上述實驗表明，PTGR可以通過光誘導產生ROS，而ROS具有殺死癌細胞的能力。由此證明PTGR具有光動力治療的潛能。

圖7 PTGR分別在避光和光照(功率密度：30 mW cm-2)條件下，在HeLa細胞內產生ROS的情況。其中，blank為空白組。比例尺：20 μm

2.2.4 對癌細胞線粒體的損壞能力的檢測

如圖8所示，在避光條件下，HeLa細胞內的JC-1染料基本沒有綠色熒光，隨著光照時間的增加，綠色熒光越強，紅色熒光越弱。這是因為PTGR釋放的PpIX富集在HeLa細胞的線粒體周圍，并通過激光誘導產生大量ROS，有效破壞 HeLa細胞的線粒體。此外，隨著光照時間增加，PTGR對線粒體的破壞越大。以上實驗表明PTGR能夠在光照條件下，有效破壞癌細胞的線粒體，從而實現光動力治療的目的。