肺腺癌關鍵基因的生物信息學研究

劉冬琦，竇涪琳，楊曉東*

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.山東大學第二醫院，山東 濟南250033)

肺癌是世界上發病率和致死率最高的惡性腫瘤，肺腺癌(LUAD)目前已成為肺癌中最主要的病理類型，占所有肺癌患者的80%-85%[1]。盡管早期診斷和治療方法取得了顯著進展，但5年相對總生存率(OS)仍低于20%[2]。對于不能手術的癌癥患者和手術患者，化療仍然是最重要的輔助治療，然而，藥物不良反應及耐藥性制約著化療的最終效果。因此，迫切需要新的策略來補充傳統的化療[3]。在過去的幾十年里，我們通過基因組學提高了對癌癥分子特征的認知。晚期非小細胞肺癌的治療策略已經從傳統的基于組織病理學的化療轉變為基于致癌因素的個體化精確治療[4]。雖然發現的生物標志物和治療靶點對LUAD的診斷和治療做出了巨大貢獻，但由于LUAD的生物學復雜性和較差的預后，迫切需要更多的遺傳信息，以提供精確醫療的參考[5]。為了探索與癌癥相關的常見生物標志物和用于癌癥治療、診斷和預后的直接藥物，近年來各國學者發布了諸多的癌癥基因芯片和高通量測序數據[6-9]。同時，為了克服不同技術平臺或小樣本應用帶來的局限性，生物信息學方法被廣泛應用于癌癥相關領域研究，發現了大量有價值的生物信息[10-12]。

應用GSE33532、GSE40791和GSE19188的基因芯片數據，利用生物信息學方法識別LUAD組織與正常組織之間的差異表達基因(DEGs)。此外，還建立了1354個hub基因和3個核心模塊的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡。同時，通過Kaplan-Meier Plotter在線數據庫發現NSCLC中有8個與OS相關的基因。此外，還對DEGs進行了富集分析。本研究旨在從新的角度識別與NSCLC發病和預后相關的關鍵基因。

1 材料方法

1.1 數據獲取

我們在基因表達綜合數據庫(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO)篩選出GPL570數據集中包含肺腺癌樣本及正常組織樣本的基因表達譜數據(GSE33532、GSE40791、GSE19188、GSE31548、GSE43458)，在R軟件(3.5.2版，https://www.R-project.org/)環境下，使用affy/ affyPLM軟件包生成各個基因表達譜數據的RNA降解圖，篩選5’-3’逐漸升高的數據。最終3個表達譜數據納入研究(GSE33532、GSE40791、GSE19188)。

所有數據都是基于Affymetrix人類基因組U133 Plus 2.0基因芯片，包含共計364例樣本被納入本項研究，其中包含179例肺腺癌樣本和185例正常肺組織樣本。

1.2 基因芯片數據分析

在R軟件(3.5.2版，https://www.R-project.org/)環境下，使用affy軟件包對數據預處理和識別、預處理和規范化。使用Limma包對每個GEO數據集的矩陣數據進行歸一化和log2轉換，每個基因芯片中的差異表達基因也由Limma 包進行篩選。|log2FC|≥2、調整P值<0.05為差異有統計學意義。

1.3 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

DAVID數據庫(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，https://david-d.ncifcrf.gov/home.jsp)是一個強大的基因功能分析工具，可對DEGs的GO進行注釋及富集分析，去研究DEGs的生物功能，包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)。KEGG(https://www.kegg.jp/)可用于通路分析。P<0.05為存在顯著性差異。

1.4 蛋白相互作用網絡構建和模塊分析

STRING數據庫(STRING，https://string-db.org/)是一個探索PPI的在線工具。從STRING數據庫中獲得DEGs中的PPI信息，使用Cytoscape 3.7.1軟件進一步構建。使用軟件中的cytoHubba模塊對所有DEGs進行篩選，并根據Degree進行排序，篩選出排名前十的基因作為核心基因(Hub genes)，應用MCODE插件篩選出評分均>10的模塊。并以各模塊DEGs為基礎進行KEGG富集分析。P<0.05存在顯著性差異。

1.5 數據驗證

基因表達譜交互分析(GEPIA)是一個在線網絡工具，可以對癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因型組織表達(GTEx)的腫瘤和正常數據進行基因表達分析，并將結果繪制成箱線圖，我們可以在該網站調取Hub genes在LUAD組織中的表達情況來驗證本研究數據的可靠性和重復性。

1.6 Hub genes的生存分析

生存曲線庫 (K-M plotter，http://kmplot.com/)是一個在線數據庫，基于GEO、TCGA數據庫，分析腫瘤中某特定基因與死亡時間的關系，結果以95%置信區間和危險比來表示。本研究對Hub genes在肺腺癌中預后預測價值進行了分析。

2 結果

2.1 差異基因

在GEO數據庫GPL570數據平臺中選取的5個包含肺腺癌及正常肺組織基因芯片的數據集，并根據RNA降解情況(圖1)選取了其中3個(GSE33532、GSE40791、GSE19188)共計364例樣本被納入本項研究，并對其中179例LUAD和185例正常肺組織進行了分析，共篩選出1354個DEGs(938個下調基因及416個上調基因)，見圖2。

2.2 差異基因的生物學功能注釋

為了進一步了解差異基因的功能，應用DAVID數據庫確定其GO分類及途徑。結果表明，BP方面，下調的DEGs主要聚類于細胞黏附、生物附著、血管生成等，上調的DEGs主要聚類于M期、凋亡、細胞核分裂等。在分子功能方面，下調的DEGs主要聚類于碳水化合物結合、生長因子結合、結合方式等，上調的DEGs主要聚類于抗原結合、微管主動運動、金屬內肽酶活性等。細胞成分分析結果顯示，上調的DEGs主要聚類于紡綞體、染色體、濃縮染色體等，下調的DEGs主要聚類于細胞外、細胞膜，見圖2。

2.3 DEGs的KEGG途徑分析

如圖3所示，上調的DEGs在細胞周期、p53信號通路、細胞外基質受體相互作用、卵母細胞減數分裂等通路中顯著聚集。下調的DEGs主要富集于細胞黏附分子、血管平滑肌收縮、補體途徑、黏著等。

圖1 RNA降解圖

圖2 DEGs的GO及KEGG富集分析

2.4 PPI網絡結構分析

在SRTING數據庫的基礎上，用Cytoscape軟件構建出的蛋白相互作用網絡，包含817個節點和5557條連線(圖4)，應用cytoHubba模塊根據Degree篩選出前八個基因作為hubgenes，分別為CDK1、CDC20、CCNA2、CCNB1、BUB1、CCNB2、TOP2A及AURKB。應用MCODE插件共檢測到3個評分>10的模塊，對以上模塊進行富集分析，其各自主要聚集途徑這八個hub genes均在LUAD中高表達，且均在第一個模塊內聚集(圖5)。

圖3 KEGG 富集分析

2.5 數據驗證

應用GEPIA篩選了LUAD組織和正常組織之間的hub基因表達水平，圖6反映了與正常組織相比，這8個基因在LUAD組織中的表達水平顯著增高。

圖4 PPI網絡結構圖，藍色為上調基因，紅色為下調基因

圖5 三個核心模塊及其KEGG富集情況

圖6 hub genes在LUAD的表達情況

2.6 hub基因的預后價值

本研究采用K-M Plotter評價8個hub基因的預后預測價值。肺腺癌患者的總生存率是根據每個基因的高表達和低表達來計算的。腺癌患者中CDK1、CDC20、CCNA2、CCNB1、BUB1、CCNB2、TOP2A及AURKB高表達者OS更差，見圖7。

圖7 hub genes相關生存曲線

3 討論

目前，肺腺癌已成為肺癌的最主要類型，然而，其發生和發展的潛在分子機制仍未充分闡明。本研究采用生物信息學方法預測肺癌的潛在治療和預后評估靶點，并探討肺癌可能的分子機制。本研究共篩選出1354個差異基因，其中938個下調基因，416個上調基因，通過構建PPI網絡和富集分析，結合生存分析結果，共篩選出8個過表達關鍵基因CDK1、CDC20、CCNA2、CCNB1、BUB1、CCNB2、TOP2A及AURKB。在生物過程方面，下調的DEGs主要聚類于細胞黏附、生物附著、血管生成等，上調的DEGs主要聚類于M期、凋亡、細胞核分裂等，這與以前的認識一致，即細胞周期和細胞增殖調節因子的功能缺陷是腫瘤發生和發展的主要原因。根據Cavallaro等學者[13]的研究，細胞黏附分子表達的改變可以影響細胞的黏附功能、細胞的信號轉導狀態、細胞與環境的相互作用，并在腫瘤的進展、侵襲和轉移中發揮重要作用。我們的結果提示，這些上調和下調的DEGs參與了這些BP，可能在NSCLC的進展中起重要作用。

本結果顯示這8個過表達的hub genes 均與模塊1相關，模塊1在細胞周期途徑中富集。表明這些基因均參與了細胞周期途徑，并在癌癥發展中發揮了重要的作用。

CDC20作為一種調節蛋白，在細胞周期的多個點上與其他幾種蛋白質相互作用，它需要兩個微管依賴的過程，后期的核運動和染色體分離。CDC20的高表達可預測肺癌患者甚至肺腺癌患者的預后不良[14]。CDC20的高表達與肺癌以外的許多癌癥的預后不良相關，并且與腫瘤分級和分期相關[15]。

CCNB1作為參與有絲分裂的關鍵調控蛋白，在細胞周期G2/M轉換中起著重要作用。Soria等人[16]的工作建立了CCNB1在非小細胞肺癌中的表達。結果表明，不同亞型的NSCLC不僅在生物學上存在差異，而且在CCNB1表達上也存在差異。在所檢測的所有病理性分型中，CCNB1在鱗狀細胞癌(SCC)中的過表達更為常見。這種過表達也會影響患者的生存時間，并可能成為SCC患者的不良預后標志物。細胞周期蛋白A2(CCNA2)是哺乳動物A型細胞周期蛋白家族中的一員。CCNA2控制細胞周期的G1/S和G2/M轉換。在乳腺癌、肝癌、前列腺癌和肺癌等多種腫瘤中發現其蛋白表達升高，并可能成為預測生存率或早期復發的預后指標[17]。

Ⅱ型拓撲異構酶包含兩種同工酶：TOP2A和TOP2B。在多種癌癥中均檢測到TOP2A的高表達，更重要的是TOP2A已成為公認的可用于臨床中的癌癥靶點。在乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌和非小細胞肺癌，TOP2A在中、低分化腫瘤中的表達明顯高于高分化腫瘤。TOP2A在NSCLC組織中的高表達水平與腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學行為密切相關，對TOP2A表達的干擾也可以抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲[18]。

BUB1編碼一種通過磷酸化有絲分裂啟動子復合體的成員并激活紡錘體啟動子而在有絲分裂中起無中心作用的堿/蘇氨酸蛋白激酶。該基因的異常表達和突變與非整倍體和多種癌癥有關。迄今為止，越來越多的證據表明，BUB1在各種癌癥(包括胰腺癌和胃癌)中顯著過表達與不良預后相關[19,20]。BUB1在不同類型癌癥中不同作用的一個原因可能是不同的表達水平。然而，在本研究中，我們發現BUB1在LUAD中顯著過表達，并與腫瘤不良預后相關，表明BUB1可能在LUAD的發生和發展中起作用。

AURKB是編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶亞家族的一個成員，參與有絲分裂和減數分裂過程中染色體排列和分離的調節。已有研究證實，通過抑制AURKB，人肺癌細胞具有抗腫瘤和放射增敏作用[21]。

此外，我們研究的Kaplan-Meier繪圖儀生存分析表明，這8個hub基因的mRNA表達水平與肺癌的臨床預后顯著相關。雖然這些可能暗示了它們在NSCLC進展中的作用，從而使它們成為NSCLC診斷和治療的潛在靶點，但仍有必要對每個hub基因及其亞型的臨床意義進行進一步的實驗驗證。

與以往的研究相比，本研究整合了來自多個數據集的相對較大樣本量的基因芯片數據，并通過RNA降解圖篩選出了質量較高的幾組數據進行研究，結果可信度更高。雖然本研究通過生物信息分析，篩出了肺腺癌潛在的診斷和預后生物標志物，但結論仍有待于相應的實驗證實。