喉鱗狀細胞癌中PI3K抑制劑對HMGA1基因表達的影響

張云龍，宋曉飛，段云靜，趙輝明,趙瑞力，曹云云

(1.石家莊市第一醫院 a.重癥醫學科三病區; b.耳鼻喉科，河北 石家莊050011；2.河北省人民醫院 耳鼻喉科；3.河北醫科大學第四醫院 耳鼻喉科)

喉部原發性惡性腫瘤中主要為鱗狀細胞癌，是耳鼻咽喉各部惡性腫瘤中常見類型之一。原癌基因廣泛存在于人類真核細胞基因組中，在正常情況下不表達或只低表達，當受到致癌因子激活后可發生癌基因的活化、點突變，引起過度表達或表達異常產物，致細胞癌變。PI3K生長因子信號通路在胚胎發育和許多生理過程中起著重要作用，如免疫反應的產生。此通路經常在癌組織中激活，可加速細胞分裂并參與其他信號通路活化，如MAPK、JAK-STAT、 TGFβ，從而在促進腫瘤生長、轉移和增加治療抵抗行為中發揮作用[1]。原癌基因HMGA1為一結構轉錄因子，通過調節轉錄調控蛋白與DNA相互作用，重組染色質結構促進腫瘤發生，在宮頸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多系統腫瘤中均可發現此基因過度表達[2]。喉鱗狀細胞癌中此兩種基因相互活化、共同促進表達增加的分子生物學機制未見有文獻闡明。本課題組對癌組織及癌旁正常組織，分別用免疫組織化學SP法檢測PI3K、HMGA1的表達情況，另采用RT-PCR分組比較ERK抑制劑應用人喉癌Hep2細胞后HMGA1表達情況，并分析HMGA1基因的表達和多種臨床病理參數之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

選取石家莊市第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科2012至2017年行喉癌手術切除標本，經HE染色后嚴格篩選，留取標本中喉鱗狀細胞癌47例，癌旁正常組織21例。其中：病理分級依據2005WHO腫瘤分型標準[3]，高分化(G1、G2)37例，低分化(G3)10例；根據(UICC)TNM分類標準[4]；臨床分期(Ⅰ、Ⅱ)18例，(Ⅲ、Ⅳ)29例；淋巴結轉移分組：N+(有淋巴結轉移)26例，N0(無淋巴結轉移)21例；吸煙分組參考Zuo JingJing吸煙與喉癌風險關系[5]，以煙齡(年)×每日吸煙量(支)計數，陽性(≥400)38例，陰性(<400)9例；解剖分區：聲門上區21例，聲門區26例。

Hep2細胞為人喉癌細胞株，取于石家莊市第一醫院科研中心，將Hep2細胞接種于含10%胎牛血清DMEM培養基(其中含青霉素、鏈霉素100 U/ml),置37℃，5%CO2環境培養，觀察細胞長勢2至3天更換培養液，3至5天傳代1次。細胞融合度70%-80%時更換為無血清培養基12小時后分組備用。

1.2 試劑

免疫組化使用到的關鍵試劑： PI3K、HMGA1均為鼠抗人單克隆抗體(型號分別為20584-1-AP、Sc-8982)；均為美國Santa Cruz Biotechnology 生產。SP-9002二抗免疫組化試劑盒以及ZLI-9032 DAB顯色液生產廠家為北京中杉金橋生物公司。

RT-PCR 關鍵試劑：PI3K抑制劑wortmannin(9951s)購自美國Cell Signaling Technology Company，用于提取RNA的TRIzol為美國SBS Co.,ltd生產，RT-PCR 試劑盒生產廠家為美國Promega Co.,ltd，DNA Marker購自北京索來寶科技有限公司，PCR 引物： HMGA1上游引物為(5’→3’) CGGGGCCGACCAAAGGGAAG,下游引物為(5’→3’) CGGTGGGAGCGGAGCAAAGC。GAPDH內參：上游引物(5’→3’)AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG,下游引物(5’→3’)AGGGGTCATTGATGGCAACA。均購自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

免疫組化SP法：將收集組織標本制作蠟塊并切片，經脫蠟、水化、抗原修復、除酶、血清封閉后孵育、沖洗、加一抗、再沖洗后滴加二抗、反復沖洗后滴加辣根酶工作液、再孵育沖洗后加DAB顯色，后經復染、酚化、氨水返藍，再次脫水、加二甲苯后封片觀察；PBS液做對照實驗。RT-PCR方法：將已培養人喉癌Hep2細胞隨機分為A、B組，A組為實驗組，將200 nmol/L wortmannin置細胞無血清培養液中共同培養24 h。B組為對照組，所選細胞置無血清培養液繼續培養24 h；按時收取細胞，分別提取實驗組與對照組中RNA，隨后按逆轉錄試劑盒說明書要求，將所得產物逆轉錄成cDNA，在進行PCR擴增：95℃8分，95℃45秒， 66℃30秒，72℃25秒，共35次循環后，置72℃延伸7分鐘。所得的產物放置2%瓊脂糖凝膠進行電泳后觀察并與Marker對照，HMGA1所獲得的產物分別為229 bp，GAPDH是104 bp。

1.4 結果判定

免疫組化結果參照Fromowitz評分方法[6]：染色強度(intensity，I)分類，其中無染色為0級，弱染色(淺黃)為1級，中染色(棕黃)定為2級，強染色(棕褐) 定為3級；陽性細胞百分率(percentage，P)分級，陽性細胞P<5%為0級； 5%≤P<25%為1級，25%≤P<50%為2級，P≥50%為3級。組織學評分(histologiescore，H)=I×P。若同一標本不同區域存在差別，則取均值評分。當分值為0至3分記陰性，為低表達；分值為4至6分記陽性，為中度表達；分值為7至9分記強陽性，為高表達。RT-PCR結果應用Gel work-2ID軟件分析光亮度值，相對表達量為兩目的基因條帶光密度值與對應GAPDH光密度值的比值。

1.5 統計方法

2 結果

2.1 免疫組化結果

PI3K蛋白陽性染色相對較深，呈棕褐色，以細胞質為主，少量分布在細胞核(圖1)。在LSCC組織中陽性率70.2%(33/47)，癌旁組織中,陽性率 33.3%(7/21)。表明PI3K基因在LSCC組織中的陽性表達率高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=8.150，P<0.05)(參見表1)。HMGA1蛋白表達對應的顏色為棕色，散在分布于細胞質以及細胞核當中(圖2)。在癌組織當中，陽性率53.2%(25/47)，在癌旁組織當中，陽性率23.8%(5/21)。組間存在顯著差異，具有統計學意義(χ2=5.083，P<0.05)(表1)。

圖1 PI3K基因在癌旁正常組織及LSCC組織中表達

圖2 HMGA1基因在癌旁正常組織及LSCC組織中表達

表1 LSCC及癌旁正常組織中PI3K、HMGA1蛋白表達

2.2 RT-PCR 檢測結果

在人喉癌Hep2細胞中分別檢測加用PI3K抑制劑的實驗組及不加抑制劑的對照組中HMGA1 mRNA水平表達(圖3)，表達量實驗組為(0.59±0.27)；對照組為(0.18±0.17)，實驗組與對照組對比差異有顯著統計學意義(P<0.01) (表2)。

圖3 RT-PCR檢測實驗組與對照組中HMGA1mRNA水平表達電泳圖像，其中單數(1、3、5、7)為實驗組電泳圖，雙數(2、4、6、8)為對照組電泳圖

2.3 LSCC組織中HMGA1基因蛋白表達在多個臨床病理參數組內對比情況(表3)

臨床分期組內對比分析差異有顯著統計學意義(P<0.05),另外淋巴結轉移及吸煙組內對比分析差異有統計學意義(P<0.01)；但年齡、病理分級、解剖分區組內對比，差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

磷脂酰肌醇3激酶為脂質激酶家族中的一類，其通過在細胞內傳遞級聯信號調控多種生物過程。在癌組織中PI3K可通過多種機制被激活，PI3KCA基因編碼p110α亞基自身突變，激活的受體酪氨酸激酶如EGFR、HER2和PDGFR參與PI3K通路，直接與RAS通路結合互相活化，PTEN(一種與PI3K功能相反，并能降解PI3K產物的激酶)磷酸化失活等。因此推測PI3K信號通路為癌癥發生和發展的關鍵核心通路之一[7]。HMGA1為一種癌胚基因，高表達于組織胚胎時期，沉默于不再發育的成年細胞中，但多種惡性腫瘤中表達再次活躍。此基因為一種結構轉錄因子，能重組染色質結構，促進不同組織中轉錄調控蛋白和DNA之間相互作用，誘導細胞增殖、侵襲、凋亡抑制等行為，并能夠參與EGFR、Hippo、Ras/ERK、Akt等多個通路激活促進細胞惡性轉化[8]。

表2 實驗組與對照組中HMGA1 mRNA的表達

表3 LSCC中HMGA1蛋白表達與各臨床病理參數的關系

本實驗發現在LSCC組織中PI3K、HMGA1蛋白水平表達相比癌旁組織均明顯升高，經對比分析，差異存在統計學意義。提示PI3K、HMGA1在腫瘤的發生過程中發揮一定作用。Liu等[9]發現上皮-間質轉化(EMT)在卵巢癌中普遍存在。EMT是腫瘤侵襲和轉移的早期事件，鈣相關信號通路PI3K/Akt激活是癌癥進行過程中EMT發揮作用的關鍵步驟，而瞬時受體電位離子通道(TRPM7)對二價陽離子有高度滲透性，可提高如鈣離子、鎂離子水平。由此推測TRPM7可通過調節鈣離子水平激活PI3K/Akt信號通路，導致卵巢癌侵襲和轉移增加。Md.Zahid Akhter等[10]應用抗癌藥物ADM(阿霉素)處理的實驗細胞，c-myc mRNA表達水平呈時間依賴性下調，進一步證實ADM處理的宮頸癌HeLa細胞系中HMGA1蛋白和mRNA水平表達下降，提示HMGA1過表達與細胞惡變、癌癥進展有關。

Jing Zhong等[11]在進行甲狀腺癌細胞中TGF-β1對HMGA1表達影響的實驗中，發現應用RNA isolation和RT-PCR方法檢測PI3K/Akt通路抑制劑(wortmannin)處理的甲狀腺癌SW579細胞中HMGA1轉錄降低，免疫熒光染色方法對比分析顯示PI3K/Akt通路(wortmannin)可阻止TGF-β1誘導的HMGA1表達增強，由此可推測甲狀腺癌SW579細胞中TGF-β1通過刺激PI3K/Akt通路活化誘導HMGA1表達，進而促進癌細胞侵襲和轉移。Liau等[12]將PIRES-HMGA1質粒轉染的胰腺導管癌MiaPaCa2細胞與不同濃度的PI3K抑制劑組合行軟瓊脂實驗，結果顯示：加入PI3K抑制劑后，與未轉染的空白pIRES-puro3對照組相比，實驗組中，接受轉染的MiaPaCa2細胞復制水平顯著降低。表明PI3K可調控HMGA1促進腫瘤發生。這些結論均與本實驗研究結果“應用PI3K通路抑制劑后檢測喉癌細胞HMGA1mRAN表達量明顯減少”一致。

LSCC組織中HMGA1在表達蛋白水平：淋巴結轉移(N+組與N0組對比組間的差異有顯著統計學意義)、臨床分期(Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期分組組間對比差異有統計學意義)，吸煙(陽性組與陰性組對比組間的差異有顯著統計學意義)。而病理分級組內對比差異無統計學意義。Mendez等[13]針對乳腺癌分子機制研究時發現三陰乳腺癌(TNBC)細胞中HMGA1過表達，并且HMGA1從細胞核向細胞質定位的改變預示著TNBC原發性腫瘤的侵襲性增強。應用HMGA1阻斷抗體后，體外實驗中TNBC腫瘤的侵襲性減弱，免疫實驗中癌細胞的轉移率降低。實驗結論強烈建議將HMGA1作為預測TNBC遠處轉移的生物標志物。另外Qin[14]研究發現相比永生化的人類泌尿上皮細胞系SV-HUC-1，膀胱癌細胞株T24和5637中表達低水平的let-7i和高水平的HMGA1，應用let-7i質粒轉染的T24和5637細胞系中，檢測HMGA1蛋白和mRNA表達水平明顯下調，并表現出細胞增殖和遷移明顯降低。結果表明：以抑制HMGA1靶基因表達為目的，上調let-7i，可減弱人類膀胱癌細胞株T24和5637的增殖和遷移。綜合以上兩篇文獻正反方面研究，結合本實驗結果可推斷HMGA1在促進喉鱗癌浸潤、轉移中發揮作用。本實驗結果：吸煙(陽性組高于陰性組)，差異有顯著統計學意義。提示HMGA1在吸煙促進喉癌發生中起到一定作用。相關文獻為Credico等[15]對匯總了國際頭頸癌流行病學聯盟(INHANCE)的18260例頭頸惡性腫瘤(包括喉癌)和29844例對照病例行33項病例對照研究，評估吸煙強度、吸煙時間和頭頸癌之間的量效關系，結果表明：吸煙與喉癌風險之間在劑量-反應和時間-反應上的顯著正相關性。結合本研究結果目前認為喉癌的主要危險因素是吸煙，吸煙與喉癌發生關系更為密切一致。

人們在研究腫瘤的致病因素過程中逐漸意識到PI3K、HMGA1這兩種基因的重要性。本次研究結果顯示，PI3K以及HMGA1在喉鱗癌組織當中的基因發生了明顯的表達升高，并且它們之間的激活也呈現出正相關性，表明此兩種基因能夠利用類似的方法并相互影響對喉鱗狀細胞癌發生、發展產生一定促進作用，對PI3K、HMGA1表達水平的檢測可以為喉癌的診斷、進展及預后提供重要參考價值，同時也可為基因靶向治療提供可參考靶點。