過表達(dá)APE1對(duì)糖尿病心肌病小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的研究

吳浩翔,姜佳美,吳 鏗

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣東 湛江524001)

糖尿病是全球高發(fā)性疾病，其患病率正以驚人的速度增長。最近的預(yù)測表明，到2045年全球?qū)⒂?億成人患有糖尿病[1]。重要的是，糖尿病患者發(fā)生相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加，包括腎病、神經(jīng)病、視網(wǎng)膜疾病和心血管疾病[2]。盡管糖尿病導(dǎo)致心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加了五倍，但這不能完全歸因于高血壓和冠心病的存在[3]。實(shí)際上，糖尿病患者會(huì)發(fā)展出一種獨(dú)特的心力衰竭，稱為糖尿病性心肌病(DCM)，其特征是在沒有收縮功能障礙的情況下出現(xiàn)最初的舒張功能障礙[4]。盡管受到了廣泛關(guān)注，但DCM的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了[5]，所以目前不存在DCM特異性的治療措施。糖尿病環(huán)境引起心臟中幾種細(xì)胞類型的改變，包括心肌細(xì)胞，心臟成纖維細(xì)胞，炎性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。這些變化促進(jìn)有害的心臟重塑，包括心臟肥大、心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化。

近年來，氧化應(yīng)激及其所致 DNA 損傷在 DCM 發(fā)病中的作用受到了越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在DCM 動(dòng)物模型中，血或尿ROS水平和DNA損傷標(biāo)志物8-羥基-脫氧鳥苷(8-OHdG)顯著升高，而且與DCM嚴(yán)重程度密切相關(guān)[6]。脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶 1(APE1)是堿基切除修復(fù)途徑(BER)的關(guān)鍵限速酶，同時(shí)也具有氧化還原功能[7]。本人所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)：DCM患者血清中的APE1的表達(dá)顯著增加，然而DNA核酸內(nèi)切酶的活性卻明顯降低[5]。于此同時(shí)，課題組也指出需要進(jìn)一步研究APE1的表達(dá)與DCM之間的直接聯(lián)系，例如在DCM細(xì)胞水平和動(dòng)物模型水平研究APE1的表達(dá)和功能[8]。在此之后，后續(xù)研究又發(fā)現(xiàn)了糖尿病(高糖)環(huán)境下心肌內(nèi)皮細(xì)胞外泌體中APE1表達(dá)增加，活性降低，介導(dǎo)氧化應(yīng)激、DNA損傷和細(xì)胞功能障礙，以此實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平對(duì)APE1的驗(yàn)證[9]。以此為基礎(chǔ)，為了探討APE1在DCM 動(dòng)物模型中的作用及機(jī)制，課題組設(shè)計(jì)并完成了本課題。本課題通過APE1對(duì)相關(guān)氧化應(yīng)激因子和炎癥因子的影響來探討APE1對(duì)DCM小鼠心肌保護(hù)作用及其相應(yīng)機(jī)制，為APE1在DCM的臨床治療中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所用的心肌特異性高表達(dá)APE1轉(zhuǎn)基因小鼠來自于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心衰老相關(guān)心腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[10]。轉(zhuǎn)基因小鼠以C57BL/6J (野生型)小鼠為遺傳背景進(jìn)行繁育。野生型小鼠購于賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的開展取得了廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑STZ(純度 99%)及測定ROS的試劑盒購自美國 Sigma 公司。SOD、MDA測定試劑盒購于南京建成生物制品有限公司。IL-1β、IL-6 、TNF-α及葡萄糖測定試劑盒均購買于北京萊爾生物科技有限公司。

1.3 儀器雙目顯微鏡、熒光與相差顯微鏡(日本 Olympus)、全自動(dòng)彩色病理圖像分析系統(tǒng)、超速冷凍離心機(jī)、 熒光及紫外分光光度計(jì)(美國 PE)、超凈工作臺(tái)、MDF-3820 超低溫冰箱(日本 Sanyo)。

1.4 方法

1.4.1造模和分組 APE1轉(zhuǎn)基因PCR陽性雄性小鼠與其同窩雄性陰性對(duì)照小鼠經(jīng)過1周適應(yīng)性喂養(yǎng)。將60只小鼠隨機(jī)分成4組：普通飼料喂養(yǎng)的陰性小鼠對(duì)照組(CON組)、普通飼料喂養(yǎng)的APE1轉(zhuǎn)基因小鼠組(CON+APE1組)、高糖高脂飲食結(jié)合STZ的陰性小鼠對(duì)照組(DCM組)和高糖高脂飲食結(jié)合STZ的APE1轉(zhuǎn)基因小鼠組(DCM +APE1組)，每組各15只小鼠。DCM組和DCM+APE1組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，禁食不禁水約12小時(shí)，腹腔注射STZ(30mg·kg-1)72 h,測隨機(jī)血糖，選取血糖濃度> 11.1 mmol·L-1診斷為糖尿病小鼠。若未符合標(biāo)準(zhǔn)，再次重復(fù)上述操作，篩選出理想的DCM小鼠。CON組和CON+APE1組小鼠腹腔注射相應(yīng)劑量的檸檬酸鈉緩沖液。再培養(yǎng)8周后，取新鮮動(dòng)物標(biāo)本，置于-80℃冰箱保存。

1.4.2藥物制備 冰上避光配制STZ，將其溶解于0.1 mmol·L-1的檸檬酸緩沖液中(pH=4.5)。

1.4.3分離血清測血糖 腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)72 h后,提前給予小鼠禁食12 h,不禁水，用75%酒精擦拭小鼠尾端，尾靜脈采血，血糖試紙沾取少許血液，血糖儀測量血糖。

1.4.4心肌細(xì)胞及間質(zhì)的觀測 在光學(xué)顯微鏡下，應(yīng)用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)及其心肌結(jié)構(gòu)的改變；應(yīng)用馬松(Masson)染色觀察心肌間質(zhì)纖維化的程度。應(yīng)用TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞的凋亡情況。

1.4.5酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠心肌組織中炎癥因子及氧化應(yīng)激指標(biāo) 在冰上取小鼠50 mg 心肌組織，用超聲破碎儀磨成勻漿。按照試劑盒說明書，檢測各組小鼠心肌組織中炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-a 的含量和氧化應(yīng)激因子ROS，MDA，SOD的活性指標(biāo)。

1.4.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 25.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(方差齊性數(shù)據(jù))；多組數(shù)據(jù)比較用方差分析(ANOVA)，若ANOVA顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則進(jìn)一步組間兩兩比較，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重和血糖分析

STZ(30 mg·kg-1)注射后72小時(shí)，DCM組及DCM+APE1組小鼠血糖水平升高，均高于11.1 mmol·L-1。與CON組及APE1組小鼠相比，DCM組及DCM+APE1組小鼠血糖水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而CON組與APE1組之間則差異不具有顯著性(P>0.05)，表明糖尿病小組模型造模成功。實(shí)驗(yàn)到達(dá)終點(diǎn)時(shí)，DCM組及DCM+APE1 的體重比CON組減低，血糖比CON組升高，差異具有顯著性(P<0.05)。與DCM組比較，DCM+APE1組體重增加，并且DCM+APE1組血糖水平較DCM組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 小鼠體重及血糖變化

注：*P<0.05 與CON組比較；#P<0.05 與DCM組比較； DCM：糖尿病心肌組；CON：陰性對(duì)照組。

2.2 APE1 對(duì)DCM小鼠心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)的影響

CON組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，界限清楚。DCM組小鼠心肌細(xì)胞核呈現(xiàn)不規(guī)則形狀、腫脹、固縮甚至消失，有核裂解和核丟失，排列疏松紊亂，界限模糊。細(xì)胞質(zhì)呈顆粒狀，分布不均，呈現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤。CON組小鼠心肌纖維排列整齊，無增粗，膠原纖維無明顯沉積。DCM組小鼠心肌纖維排列紊亂，纖維粗大，膠原纖維沉積呈藍(lán)染。DCM+APE組心肌纖維化明顯降低，增粗藍(lán)染的膠原纖維大幅減少(見圖1，2)。

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)HE染色

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)Masson染色

2.3 APE1對(duì)DCM小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色用來分析心肌細(xì)胞的凋亡情況，可見CON組及CON+APE1組心肌凋亡細(xì)胞較少，DCM組心肌凋亡細(xì)胞明顯增多。與DCM組相比，DCM+APE1組心肌凋亡細(xì)胞明顯減少(見圖3)。

圖3 各組小鼠心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)TUNEL染色

2.4 APE1對(duì)DCM 小鼠心肌組織勻漿中SOD，ROS水平的影響

與CON組比較，DCM組SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA和ROS含量明顯升高(P<0.05)；與DCM組相比，DCM+APE1組SOD活性明顯升高(P<0.05),MDA和ROS含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠心肌組織中SOD,MDA,ROS水平的影響

注：*P<0.05 與CON組比較；#P<0.05 與DCM組比較； DCM：糖尿病心肌組；CON：陰性對(duì)照組。

2.5 APE1對(duì)各組小鼠心肌組織中IL-6，IL-1β及TNF-α含量的影響

與CON組比較，DCM的IL-6、IL-1β和TNF-α含量明顯增多(P<0.05)。與DCM組比較，DCM+APE1組IL-6、IL-1β和TNF-α含量減少(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠心肌組織中IL-6,IL-1β,TNF-α水平的影響

注：*P<0.05 與CON組比較；#P<0.05 與DCM組比較； DCM：糖尿病心肌組；CON：陰性對(duì)照組。

3 討論

DCM最早可追溯到1972年Rubler等人對(duì)四位患有充血性心衰但并沒有發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈病變的患者的報(bào)道[11]。DCM 患者心臟功能與心臟結(jié)構(gòu)都發(fā)生變化，包括左心室肥大、心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡等病理學(xué)特點(diǎn)。本課題通過高糖高脂飲食結(jié)合STZ腹腔注射的方式誘導(dǎo)DCM小鼠模型。與CON組相比，DCM組的小鼠血糖升高，體重下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE 染色發(fā)現(xiàn)DCM小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維排列無序；Masson 染色提示DCM小鼠心肌間質(zhì)大量膠原累積；TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)DCM小鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯升高。以上證據(jù)都證實(shí)了DCM小鼠發(fā)生了心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，已成功誘導(dǎo)了DCM小鼠模型。

在糖尿病疾病狀態(tài)下，為應(yīng)對(duì)高血糖、高血脂、胰島素缺乏或抵抗等代謝性應(yīng)激或紊亂[12]，心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，超過細(xì)胞內(nèi)在的抗氧化能力，就產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，可直接或間接導(dǎo)致心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)障礙、凋亡、壞死、纖維化、心肌肥大和炎癥等[13]。ROS可引起核酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸和糖類等過氧化，誘導(dǎo)生成8-OHdG、蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)物及丙二醛等有害的氧化產(chǎn)物，從而影響心肌細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能[14]。越來越多的研究表明，在糖尿病的前提下，心肌細(xì)胞ROS生成增多，ROS經(jīng)過NF-Kβ磷酸化促進(jìn)NLRP3炎癥小體過度表達(dá)，NLRP3炎癥小體通過促進(jìn)心肌間質(zhì)炎癥反應(yīng)異常激活，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡與心肌組織纖維化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，DCM組小鼠，ROS和MDA含量明顯升高，并且炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量水平也顯著增高，說明DCM小鼠確實(shí)發(fā)生了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，與上文提及的文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

APE1是DNA氧化損傷中有堿基切除及修復(fù)功能的關(guān)鍵酶。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，大于99%的AP核酸內(nèi)切酶的活性由APE1所承擔(dān)。在過去的報(bào)道中，APE1與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后緊密相關(guān)，也與冠心病、腦卒中等疾病的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切[16,17]。因?yàn)锳PE1參與腫瘤耐藥、放療耐受、腫瘤血管形成等過程，所以APE1的高表達(dá)與腫瘤病人預(yù)后不良的程度呈正相關(guān)[18]。以往有報(bào)道稱：糖尿病患者及具有如糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥的糖尿病患者，氧化應(yīng)激反應(yīng)和DNA損傷程度有所增加，增加幅度與血糖的控制和疾病的預(yù)后有密切地聯(lián)系[8,19]。但是，APE1在參與DCM心肌損傷的發(fā)生發(fā)展中是否有其特殊的作用還不明確。

針對(duì)上述問題，本課題組展開了一系列的研究。近期發(fā)現(xiàn)：①DCM患者血清APE1蛋白表達(dá)增加，其DNA修復(fù)功能降低，而且APE1 功能與患者心室舒張功能呈正相關(guān)關(guān)系[5]。②高糖誘發(fā)心肌細(xì)胞損傷，APE1蛋白及功能也有類似變化，經(jīng)免疫沉淀和蛋白免疫印跡法驗(yàn)證為APE1蛋白發(fā)生乙?；揎梉20,21]。③APE1野生型過表達(dá)心肌細(xì)胞，能明顯抑制高糖引起心肌細(xì)胞毒性、ROS生成和DNA損傷。本研究在上述科研基礎(chǔ)上開展了動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，相比于DCM小鼠，APE1過表達(dá)的DCM小鼠確實(shí)體重有所增加，F(xiàn)BG有所下降，抑制了心肌細(xì)胞肥大和凋亡及降低了心肌纖維化的程度。同時(shí)，SOD活性有所增強(qiáng)，MDA和ROS含量有所降低。組織中的諸如IL-1β、IL-6、TNF-α的含量也有所下降，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。此結(jié)論與課題組前期在DCM患者和心肌細(xì)胞細(xì)胞水平的研究結(jié)果相一致，可以說從另一角度對(duì)課題組的結(jié)論得以補(bǔ)充說明。接下來可能需要進(jìn)一步進(jìn)行APE1抗氧化應(yīng)激和抗炎作用更深層次的分子水平的研究。

綜上所述，本研究通過制造動(dòng)物模型探討了APE1對(duì)DCM小鼠的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制與APE1的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用有關(guān)，這可為治療和改善糖尿病心肌病提供一條新的思路。