隱丹參酮納米結構脂質載體的制備及藥動學研究

郝海軍，屈戰(zhàn)果，范明松

（上海雷允上藥業(yè)有限公司技術中心，上海 201401）

隱丹參酮是從唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.根及根莖中提取得到的一種脂溶性成分，屬于二萜醌類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等活性［1-2］，對神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有很好的療效［3］，但其體內吸收較差［4］，不利于藥效發(fā)揮。目前，有大量關于固體分散體［5］、微乳［6］、固體脂質納米粒［7］、脂質體［8］等新制劑技術的報道，其中納米結構脂質載體是從固體脂質納米粒改良而來，具有較高的包封率及穩(wěn)定性，可增加藥物體內吸收及靶向性，延長藥物體內滯留時間，提高藥物生物利用度及藥效［9］。本實驗制備了隱丹參酮納米結構脂質載體，并對其粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量、體外溶出、藥動學進行了考察，以期為相關研究提供更全面的數(shù)據(jù)。

1 材料

QUINTX224-1CM 型電子天平［賽多利斯（上海）貿易有限公司］；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XW-80A 型渦旋混合器（安徽精科檢測技術有限公司）；WY-265G 型溫控磁力攪拌器（杭州精卓設備有限責任公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；RCZ-8RCZ8 型智能溶出儀（上海五久自動化設備有限公司）；FD10-QX 型真空凍干機（上海精密科學儀器有限公司）；JXDC-400 型氮氣吹掃儀［拓赫機電科技（上海）有限公司］；JY92-III 型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；Nanosep? 超濾離心管（相對分子質量10 000，美國Pall 公司）。

隱丹參酮（批號 110867-201607，純度99.5%）、克拉霉素（批號1303056-201404，純度99.6%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；隱丹參酮對照品（批號170216S，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；中鏈脂肪酸（批號B50845）、大豆卵磷脂（批號W171124S）（上海輔必成醫(yī)藥科技有限公司）；山崳酸甘油酯（批號158855，上海嘉法獅貿易有限公司）；泊洛沙姆188（批號WPE1566D，德國巴斯夫公司）。

清潔級SD 大鼠，體質量（300±20）g，購自河南省實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫）2016-0001。

2 方法與結果

2.1 隱丹參酮納米結構脂質載體制備 采用高壓均質法。稱取山崳酸甘油酯1.2 g、中鏈脂肪酸0.4 g 于圓底燒瓶中，75 ℃下加熱至熔融狀態(tài)，加入75 mg 隱丹參酮后磁力攪拌（1 000 r／min）至全部溶解，作為油相；稱取PVP K30 0.3 g、大豆磷脂0.2 g，溶于50 mL 蒸餾水中，加熱至75 ℃，作為水相。在1 000 r／min 攪拌速度下將水相勻速滴入油相中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌濃縮60 min 形成初乳（體積約為40 mL），在80 MPa 壓力下循環(huán)均質8 次后立即低溫固化，即得。同法制備不含隱丹參酮的空白納米結構脂質載體。

2.2 粒徑、Zeta 電位測定 取隱丹參酮納米結構脂質載體0.1 mL，加入5 mL 超純水稀釋，取適量測定粒徑、Zeta 電位，結果見圖1～2，可知平均粒徑為（175.26±6.07）nm，PDI 為0.068±0.009，Zeta 電位為（-34.2±3.4）mV。

圖1 隱丹參酮納米結構脂質載體粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of nanostructured lipid carries of cryptotanshinone

圖2 隱丹參酮納米結構脂質載體Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of nanostructured lipid carries of cryptotanshinone

2.3 隱丹參酮含有量測定

2.3.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.6% 甲酸（70∶30）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長271 nm；進樣量20 μL。

2.3.2 線性關系考察 精密稱取48.80 mg 隱丹參酮對照品，溶于25 mL 乙腈中，得1.952 mg／mL貯備液，精密量取1.0 mL 至20 mL量瓶中，流動相定容至97.6 μg／mL 后逐步 稀釋至0.488、0.976、9.76、24.4、48.8、97.6 μg／mL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝0.530 6X-0.481 4（r＝0.999 9），在0.488～97.6 μg／mL 范圍內線性關系較好。

2.3.3 供試品溶液制備 取2.0 mL 隱丹參酮納米結構脂質載體至25 mL 量瓶中，甲醇超聲處理后定容，8 000 r／min 離心30 min，取2.5 mL 上清液至5 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，即得。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 精密度試驗 取0.488、24.4、97.6 μg／mL對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得3 種質量濃度溶液中隱丹參酮峰面積RSD分別為0.82%、0.61%、0.18%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.2 重復性試驗 取同一批隱丹參納米結構脂質載體混懸液，按“2.3.2”項下方法處理后平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得隱丹參酮峰面積RSD 為0.66%，表明該方法重復性較好。

2.3.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批隱丹參納米結構脂質載體混懸液，按“2.3.2”項下方法處理后制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24、48 h 在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得隱丹參酮峰面積RSD 為0.83%，表明溶液在48 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.4.4 加樣回收率試驗 取1.952 mg／mL 隱丹參酮對照品溶液9.0 mL 至10 mL 量瓶中，流動相定容至1.757 mg／mL。取9 份空白納米結構脂質載體混懸液，每份2.0 mL，置于9 個25 mL 量瓶中，加入上述1.757 mg／mL 溶液1.0、2.0、3.0 mL，平行3 份，甲醇超聲處理后定容，8 000 r／min 離心30 min，取2.5 mL 上清液至5 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，隱丹參酮平均加樣回收率分別為98.81%、97.19%、98.05%，RSD 分別為0.69%、0.93%、0.67%。

2.4 載藥量、包封率測定 采用低溫超濾離心法。按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算隱丹參酮總含有量（m總）；精密量取2.0 mL 隱丹參酮納米結構脂質載體混懸液至超濾離心管中，平行制備2份，12 500 r／min 離心60 min，合并續(xù)濾液后精密量取2 mL 至50 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算游離隱丹參酮含有量（m游離），再測定載藥量、包封率，公式分別為載藥量＝［（m總-m游離）／（m總+m脂質）］×100%、包封率＝［（m總-m游離）／m總］×100%（m脂質為隱丹參酮脂質總用量）。結果，3 批隱丹參酮納米結構脂質載體平均包封率為（87.69±1.97）%，載藥量為（3.75±0.38）%。

2.5 體外釋藥研究 采用透析袋法。量取隱丹參酮納米結構脂質載體、隱丹參酮原料藥（空白溶出介質配制，含有量與納米結構脂質載體相同，均為9.1 mg）各5 mL，置于透析袋中（截留分子質量8 000～14 000 Da），兩端扎緊，設定轉速100 r／min，溫度（37±1）℃，溶出介質1.0% SDS溶液，于0、0.25、0.5、0.75、1、2、4、8、12、18、24、30、36 h 各取樣2 mL，并及時補充等量溶出介質，按1∶1 比例加入甲醇破乳后HPLC 法測定隱丹參酮含有量，繪制釋藥曲線，結果見圖3。由此可知，在釋藥初期隱丹參酮納米結構脂質載體有一定突釋現(xiàn)象，之后是緩慢釋藥期；36 h內累積釋放度為64.13%，與原料藥相比具有明顯緩釋特征。

圖3 樣品體外釋藥曲線Fig.3 In vitro drug release curves for samples

2.6 體內藥動學研究

2.6.1 灌胃液質量濃度確定 經(jīng)測定，隱丹參酮納米混懸劑質量濃度為1.82 mg／mL。因此，本實驗另選空白納米混懸劑，制成相同質量濃度的混懸液。

2.6.2 分組、給藥及血漿樣品采集 取清潔級SD大鼠12 只，隨機分為隱丹參酮組和隱丹參酮納米結構脂質載體組，灌胃給藥，劑量以隱丹參酮計為15 mg／kg。大鼠乙醚麻醉后，于0.167、0.5、1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、8、12 h 眼眶后靜脈叢采血各約0.3 mL，引流至肝素化的離心管中，眼眶棉球止血，血樣2 500 r／min 離心2 min，200 μL移液槍分離上層血漿，置于-20 ℃冰箱中。

2.6.3 血漿樣品處理 參考文獻［10］報道方法。取內標溶液40 μL、血漿樣品100 μL、甲醇3 mL至離心管中，渦旋混勻3 min 后5 000 r／min離心10 min，分離上層有機相至空白離心管中，調節(jié)氮氣體積流量，在45 ℃下緩慢吹除提取液中的有機溶劑，100 μL 流動相復溶殘渣，5 000 r／min離心5 min。

2.6.4 線性關系考察 取“2.3.2”項下貯備液，甲醇依次稀釋至 24.4、48.8、122.0、244.0、488.0、976.0 μg／L，作為對照品溶液，各精密量取0.5 mL，45 ℃下緩慢吹干，加入0.5 mL SD 大鼠空白血漿溶解；精密稱取克拉霉素對照品10 mg，溶于10 mL 甲醇中（1.0 mg／mL），甲醇稀釋至100 μg／L，作為內標溶液，按“2.6.3”項下方法處理，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以隱丹參酮與內標峰面積之比為縱坐標（Y），溶液質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為Y＝0.060 1X+0.005 2（r＝0.991 9），在24.4～976.0 μg／L范圍內線性關系較好。

2.6.5 方法學考察 取空白血漿、空白血漿加對照品與內標、給藥后血漿樣品與內標，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，發(fā)現(xiàn)內源性物質不干擾隱丹參酮、內標測定，兩者保留時間分別為6.6、7.8 min，表明該方法專屬性良好。取24.4、244.0、976.0 μg／L 血漿對照品溶液，同一天內在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得隱丹參酮峰面積RSD 分別為2.14%、1.53%、0.98%，表明該方法日內精密度良好；取上述相同質量濃度血漿對照品溶液，每天測定1 次，連續(xù)6 d，測得隱丹參酮峰面積RSD 分別為10.53%、4.69%、4.04%，表明該方法日間精密度良好。取隱丹參酮給藥1.0 h 時血藥樣品，室溫下放置72 h，測得隱丹參酮峰面積RSD 為10.86%，表明血漿樣品在72 h 內穩(wěn)定性良好。取“2.6.4”項下24.4、244.0、976.0 μg／L 對照品溶液各1.0 mL，氮氣吹干得殘渣，加入1.0 mL 空白血漿重新溶解，按“2.6.3”項下方法處理，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得隱丹參酮加樣回收率為83.44%～92.68%。

2.6.6 分析結果 以取血時間為橫坐標，血藥濃度為縱坐標，繪制血藥濃度-時間曲線，結果見圖4；通過DAS2.0 軟件計算主要藥動學參數(shù)，體內過程按照二室開放模型計算，結果見表1。由此可知，隱丹參酮制成納米結構脂質載體后可延長tmax、t1／2（P＜0.05），升高Cmax、AUC0～t、AUC0～∞（P＜0.01），相對生物利用提高到226.06%。

圖4 樣品血藥濃度-時間曲線Fig.4 Plasma concentration-time curves for samples

表1 樣品主要藥動學參數(shù)（±s，n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for samples（±s，n＝6）

表1 樣品主要藥動學參數(shù)（±s，n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for samples（±s，n＝6）

注：與隱丹參酮比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論

將游離藥物與納米藥物分開的難度較大，而且兩者之間存在動態(tài)平衡，分離前者時可能會造成后者不穩(wěn)定［10］，故本實驗未對其進行分離。隱丹參酮納米結構脂質載體在體外釋藥初期具有突釋現(xiàn)象，一方面是由于存在游離藥物，另一方面也與吸附在其表面的藥物有關。有報道［9］認為，部分納米結構脂質載體低溫固化時固態(tài)脂質先形成內核，而溶有藥物的液態(tài)脂質包裹在內核外部，從而導致突釋。另外，體外釋藥過程的緩釋特征可能是由于溶有藥物的液態(tài)脂質打亂了固體脂質的晶格，使包裹于后者的藥物溶出受阻。

隱丹參酮生物利用度較低，除了水溶性較差的原因外［5］，還與透膜吸收能力有限［11］、存在肝臟首過效應［4］等因素有關。藥動學研究顯示，將隱丹參酮制成納米結構脂質載體后tmax、t1／2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞均顯著升高，相對生物利用提高到226.06%，可有助于降低給藥量，提高藥效，其中tmax延后，可能與納米結構脂質載體緩釋特征有關；t1／2延長，表明納米結構脂質載體可增加藥物體內滯留時間；Cmax提高，說明納米結構脂質載體可促進藥物體內吸收［12-13］。由于藥物體內滯留時間延長，納米級以下粒徑的藥物與胃腸道的接觸面積也大幅增加，有利于納米結構脂質載體經(jīng)細胞間轉運、淋巴轉運等途徑進入血液循環(huán)，降低首過效應，提高生物利用度［13-15］。

此外，納米結構脂質載體中的脂質可抑制P糖蛋白等介導的藥物外排作用［16］，促進乳糜微粒產(chǎn)生，從而增加淋巴轉運途徑。上官明珠［16］報道，部分納米結構脂質載體進入腸道后，被胰酶降解成甘油酯和脂肪酸，并釋放出藥物，隨后降解產(chǎn)物、內源性膽鹽、藥物等重新形成混合膠束或膠束，從而更容易通過小腸上皮靜態(tài)水層，促進藥物經(jīng)小腸吸收。但納米藥物口服后，經(jīng)胃腸道吸收進入血液循環(huán)的過程受到納米制劑穩(wěn)定性、胃腸壁親水性黏液層阻擋、網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)中單核巨噬細胞吞噬等因素的影響［17］，最終使其生物利用度提高程度受到一定限制，而且差別也較大［18］。今后，可考慮對隱丹參酮納米結構脂質載體進行表面修飾等方面的研究［17］，以期進一步提高生物利用度。